基于深度学习的病理免疫标志物智能预测系统的构建及其验证研究

这是一篇关于深度学习,前列腺癌,雄激素受体(androgen receptor,AR)的论文, 主要内容为背景:前列腺癌在老年男性患者中尤为常见,严重影响了患者的生活质量。对于新诊断的前列腺癌,雄激素受体(androgen receptor,AR)状态是用于预后和治疗决策的关键分子标记物。在临床管理过程中,病理医师从活检组织的免疫组织化学(IHC)染色的病理切片中确定患者雄激素受体表达状态,这突出了细胞表面抗原的存在。深度学习神经网络是近年来新兴的一种技术,在图像识别领域具有优秀的效果。目的:本研究旨在前期理论研究、临床标本验证和数据分析的基础上,建立一个从苏木精/伊红染色(H&E)切片判断患者AR表达情况的深度学习神经网络,经病理医师判读AR表达状态并在HE切片上注释AR高表达区域,以此训练神经网络并在验证集上验证。在此基础上将为前列腺癌的治疗方式选择及预后分析提供一种新的判断模型,亦为前列腺癌病理分析提供一种新思路。材料与方法:本研究从各中心病理库中调取符合标准的前列腺癌患者的肿瘤中心组织的HE切片及对应的AR免疫组化切片。其中,HE切片经过扫描后处理为标准whole slide image(WSI),相应的AR免疫组化切片则由专业的病理医师判读注释AR高表达区域。使用Otsu法对HE切片的WSI进行分割并删去背景区域,从每个WSI提取的图块中随机抽取N=50个图块,组成一个的饲喂包,饲喂给搭建好的神经网络Predictor Net,以病理医师判读结果作为监督指标。使用Adam优化器优化,学习速度为10-5且权重衰减为每500 epoch衰减5*10-5。使用ROC曲线下面积(AUC)、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)作为二元分类任务的指标来衡量性能。使用二元Logistic回归分析寻找Predictor Net在何种临床情况下具有最佳预测性能。结果:依据AR高/低表达二分类AUC结果,Predictor Net在验证集上的原始AUC为0.887(CI:0.791-0.954)。对结果归一化后,在训练数据集上的AUC为0.860(CI:0.899-0.920),PPV为87.64%,NPV为83.75%;相应的在验证数据集上的AUC为0.847(CI:0.749-0.945),PPV为88.10%,NPV为80.64%。二元Logistic回归分析显示前列腺体积及术后住院时长与Predictor Net预测结果负相关,AUC结果提示随着前列腺体积或术后住院时长的增加,模型预测的准确度下降,当术后住院天数<23.96天时,Predictor Net取得最佳预测性能(AUC=0.891,CI:0.827-0.956),术后住院天数大于23.96天时预测性能最差(AUC=0.822,CI:0.742-0.902)。结论:研究者通过回顾性收集PCa患者的临床信息与病理标本,开发出了通过数字化HE切片预测AR表达水平的AI,并且达到了与专业临床医师相似的准确性。开拓了前列腺癌病理识别领域的宽度,此AI对于落后地区的AR表达水平预测以及病理科学研究具有巨大意义。

辣椒素通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥抗癌作用的机制研究

这是一篇关于前列腺癌,肿瘤干细胞,辣椒素,Wnt/β-catenin,LiCL的论文, 主要内容为[目的]选取人前列腺癌细胞株PC-3作为研究对象,采用前列腺癌细胞无血清悬浮培养克隆成球法建立前列腺癌干细胞模型。探讨经典Wnt通路对前列腺癌干细胞的调控作用,研究辣椒素是否对前列腺癌干细胞发挥抑制作用以及Wnt/β-catenin信号通路在其中的具体作用机制。本研究为揭示前列腺癌干细胞靶向干预的分子基础,阐明辣椒素对前列腺癌的干预效应及分子机制提供重要科学依据。[方法]1.无血清悬浮培养法(serum-free medium,SFM)富集干细胞肿瘤球,分别采用实时定量 PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测有血清贴壁培养(serum-suffiicient medium,SSM)组和无血清悬浮培养(SFM)组中肿瘤干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133、CD144 等)的 mRNA 和蛋白表达情况。2.细胞计数试剂盒法(cell counting kit 8,CCK8)检测不同浓度的辣椒素对前列腺癌干细胞活力的影响。3.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞增殖相关因子PCNA和P21的蛋白表达水平的影响。4.实时定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax以及前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的mRNA和蛋白水平的改变。5.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞上皮-间质转变(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关因子(Zo-1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin等)的蛋白表达水平的影响。6.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对Wnt信号通路相关蛋白(p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc、CyclinD1、Wnt2)和细胞核中β-catenin的蛋白表达水平的影响。7.蛋白免疫印迹法检测Wnt信号通路相关标记物(Wnt2、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc)的表达情况,阐明辣椒素联合LiCL对前列腺癌干细胞中Wnt信号通路的作用情况。8.细胞计数试剂盒法检测辣椒素联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞活力的影响。9.蛋白免疫印迹法检测前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的蛋白水平的改变,阐明辣椒素联合Wnt通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞干性的影响。[结果]1.无血清悬浮培养法富集前列腺癌干细胞 在未添加血清的培养基中,连续培养前列腺癌PC-3细胞,直至肿瘤球发生凋亡而解体。显微镜下每日观察发现,PC-3细胞成球状聚集生长,随着时间的延长,球体逐渐增大且颜色逐渐加深,培养7日后球体生长速率开始下降,10后逐渐走向凋亡。用SSM和SFM法分别培养细胞7日后,Western blot和qPCR结果显示,SFM组中前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的表达水平上调(P<0.01)。2.CAP抑制前列腺癌干细胞的活力 用不同浓度的CAP处理前列腺癌干细胞PC-3肿瘤球5天,检测CAP对前列腺癌干细胞活力的影响。显微镜下观察发现,与空白组比较,辣椒素可以显著抑制前列腺癌干细胞球的生长,缩小肿瘤球的体积。此外,CCK-8结果显示,CAP能降低前列腺癌干细胞的活力(P<0.05),10μM浓度的辣椒素对前列腺癌干细胞抑制作用最为显著。3.CAP抑制前列腺癌干细胞增殖促进前列腺癌干细胞凋亡 0、1μM、5μM、10μM浓度辣椒素干预后,Western blot结果显示,P21表达水平上调、PCNA表达水平下调;Bax表达水平上调、Bcl-2表达水平下调。qPCR结果显示,Bax表达水平上调、Bcl-2表达水平下调。4.CAP抑制前列腺癌干细胞干性标志物表达 qPCR和Western blot结果显示CAP使前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的mRNA和蛋白表达水平下调,并具有一定程度的浓度依赖性。5.CAP抑制前列腺癌干细胞EMT进程Western blot结果显示1μM、5μM、10μM浓度辣椒素干预后,EMT相关标志物Zo-1、E-cadherin表达水平上调,Vimentin、N-cadherin表达水平下调。6.CAP抑制前列腺癌干细胞Wnt信号通路活性 不同浓度的CAP处理前列腺癌干细胞PC-3肿瘤球5天收集蛋白,Western blot结果显示CAP显著抑制了前列腺癌干细胞Wnt/β-catenin 信号通路活性,主要表现为 Wnt2、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc 以及CyclinD1蛋白水平的下调。结果还显示不同浓度CAP干预前列腺癌干细胞后,其胞核β-catenin的蛋白水平以浓度依赖性的方式下降。7.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞Wnt信号通路的影响 实验分为空白组、10μM CAP组、10mM LiCL组和10μM CAP联合10mM LiCL(混合)组。以上4种处理方式处理前列腺癌干细胞5天后,Western blot结果显示,与空白组比较,LiCL组中标志物GSK-3β表达水平下降,p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-myc表达水平上升,10μM CAP组中标志物GSK-3β表达水平上调,p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-myc表达水平下调;与10μM CAP组比较,混合组GSK-3β蛋白表达水平下调,p-GSK-3β(Ser9)、c-Myc、β-catenin蛋白表达水平上调。8.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞活性的影响 实验分组及处理同上,CCK-8结果显示,与空白组比较,10mM LiCL组肿瘤球活力上升,10μM CAP组肿瘤球活力下降;与10μM CAP组比较,混合组肿瘤球活力上升(P<0.05)。9.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞干性的影响 实验分组及处理同上,Western blot结果显示,与未用辣椒素干预的空白组相比,10mM LiCL组CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2 表达水平上调,10μM CAP 组 CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2表达水平下调;与10μM CAP组比较,混合组CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2表达水平上调。[结论]1.无血清悬浮培养法能够有效富集前列腺癌干细胞;2.CAP影响前列腺癌干细胞的活力并抑制其增殖促进其凋亡;3.CAP抑制前列腺癌干细胞干性标志物的表达并影响其EMT进程;4.CAP抑制Wnt/β-catenin信号通路活性;5.CAP靶向Wnt/β-catenin信号通路,影响前列腺癌干细胞活性及干性标志物表达。

辣椒素通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥抗癌作用的机制研究

这是一篇关于前列腺癌,肿瘤干细胞,辣椒素,Wnt/β-catenin,LiCL的论文, 主要内容为[目的]选取人前列腺癌细胞株PC-3作为研究对象,采用前列腺癌细胞无血清悬浮培养克隆成球法建立前列腺癌干细胞模型。探讨经典Wnt通路对前列腺癌干细胞的调控作用,研究辣椒素是否对前列腺癌干细胞发挥抑制作用以及Wnt/β-catenin信号通路在其中的具体作用机制。本研究为揭示前列腺癌干细胞靶向干预的分子基础,阐明辣椒素对前列腺癌的干预效应及分子机制提供重要科学依据。[方法]1.无血清悬浮培养法(serum-free medium,SFM)富集干细胞肿瘤球,分别采用实时定量 PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测有血清贴壁培养(serum-suffiicient medium,SSM)组和无血清悬浮培养(SFM)组中肿瘤干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133、CD144 等)的 mRNA 和蛋白表达情况。2.细胞计数试剂盒法(cell counting kit 8,CCK8)检测不同浓度的辣椒素对前列腺癌干细胞活力的影响。3.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞增殖相关因子PCNA和P21的蛋白表达水平的影响。4.实时定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax以及前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的mRNA和蛋白水平的改变。5.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞上皮-间质转变(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关因子(Zo-1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin等)的蛋白表达水平的影响。6.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对Wnt信号通路相关蛋白(p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc、CyclinD1、Wnt2)和细胞核中β-catenin的蛋白表达水平的影响。7.蛋白免疫印迹法检测Wnt信号通路相关标记物(Wnt2、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc)的表达情况,阐明辣椒素联合LiCL对前列腺癌干细胞中Wnt信号通路的作用情况。8.细胞计数试剂盒法检测辣椒素联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞活力的影响。9.蛋白免疫印迹法检测前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的蛋白水平的改变,阐明辣椒素联合Wnt通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞干性的影响。[结果]1.无血清悬浮培养法富集前列腺癌干细胞 在未添加血清的培养基中,连续培养前列腺癌PC-3细胞,直至肿瘤球发生凋亡而解体。显微镜下每日观察发现,PC-3细胞成球状聚集生长,随着时间的延长,球体逐渐增大且颜色逐渐加深,培养7日后球体生长速率开始下降,10后逐渐走向凋亡。用SSM和SFM法分别培养细胞7日后,Western blot和qPCR结果显示,SFM组中前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的表达水平上调(P<0.01)。2.CAP抑制前列腺癌干细胞的活力 用不同浓度的CAP处理前列腺癌干细胞PC-3肿瘤球5天,检测CAP对前列腺癌干细胞活力的影响。显微镜下观察发现,与空白组比较,辣椒素可以显著抑制前列腺癌干细胞球的生长,缩小肿瘤球的体积。此外,CCK-8结果显示,CAP能降低前列腺癌干细胞的活力(P<0.05),10μM浓度的辣椒素对前列腺癌干细胞抑制作用最为显著。3.CAP抑制前列腺癌干细胞增殖促进前列腺癌干细胞凋亡 0、1μM、5μM、10μM浓度辣椒素干预后,Western blot结果显示,P21表达水平上调、PCNA表达水平下调;Bax表达水平上调、Bcl-2表达水平下调。qPCR结果显示,Bax表达水平上调、Bcl-2表达水平下调。4.CAP抑制前列腺癌干细胞干性标志物表达 qPCR和Western blot结果显示CAP使前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的mRNA和蛋白表达水平下调,并具有一定程度的浓度依赖性。5.CAP抑制前列腺癌干细胞EMT进程Western blot结果显示1μM、5μM、10μM浓度辣椒素干预后,EMT相关标志物Zo-1、E-cadherin表达水平上调,Vimentin、N-cadherin表达水平下调。6.CAP抑制前列腺癌干细胞Wnt信号通路活性 不同浓度的CAP处理前列腺癌干细胞PC-3肿瘤球5天收集蛋白,Western blot结果显示CAP显著抑制了前列腺癌干细胞Wnt/β-catenin 信号通路活性,主要表现为 Wnt2、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc 以及CyclinD1蛋白水平的下调。结果还显示不同浓度CAP干预前列腺癌干细胞后,其胞核β-catenin的蛋白水平以浓度依赖性的方式下降。7.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞Wnt信号通路的影响 实验分为空白组、10μM CAP组、10mM LiCL组和10μM CAP联合10mM LiCL(混合)组。以上4种处理方式处理前列腺癌干细胞5天后,Western blot结果显示,与空白组比较,LiCL组中标志物GSK-3β表达水平下降,p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-myc表达水平上升,10μM CAP组中标志物GSK-3β表达水平上调,p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-myc表达水平下调;与10μM CAP组比较,混合组GSK-3β蛋白表达水平下调,p-GSK-3β(Ser9)、c-Myc、β-catenin蛋白表达水平上调。8.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞活性的影响 实验分组及处理同上,CCK-8结果显示,与空白组比较,10mM LiCL组肿瘤球活力上升,10μM CAP组肿瘤球活力下降;与10μM CAP组比较,混合组肿瘤球活力上升(P<0.05)。9.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞干性的影响 实验分组及处理同上,Western blot结果显示,与未用辣椒素干预的空白组相比,10mM LiCL组CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2 表达水平上调,10μM CAP 组 CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2表达水平下调;与10μM CAP组比较,混合组CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2表达水平上调。[结论]1.无血清悬浮培养法能够有效富集前列腺癌干细胞;2.CAP影响前列腺癌干细胞的活力并抑制其增殖促进其凋亡;3.CAP抑制前列腺癌干细胞干性标志物的表达并影响其EMT进程;4.CAP抑制Wnt/β-catenin信号通路活性;5.CAP靶向Wnt/β-catenin信号通路,影响前列腺癌干细胞活性及干性标志物表达。

基于Wnt/β-catenin通路辣椒素对前列腺癌PC-3细胞的体内外作用研究

这是一篇关于前列腺癌,裸鼠移植瘤,辣椒素,Wnt/β-catenin,增殖/凋亡/EMT的论文, 主要内容为[目的]建立不同浓度辣椒素(capsaicin,CAP)干预前列腺癌细胞株PC-3体外模型,研究辣椒素对前列腺癌细胞活性、增殖、凋亡以及EMT进程的影响;建立体内裸鼠移植瘤模型以辣椒素灌胃处理探讨辣椒素对前列腺癌裸鼠移植瘤瘤体生长速度、瘤体组织中的细胞增殖和凋亡情况及EMT进程的影响。进一步,研究Wnt/β-caetnin信号通路在辣椒素对前列腺癌的干预过程中是否有介导作用。本研究主要探讨辣椒素对前列腺癌的干预作用,及辣椒素干预过程中具体的分子机制,以谋求为辣椒素抗前列腺癌作用提供新的科学依据,为其更进一步研究做一个基础性总结。[方法]细胞贴壁培养法培养前列腺癌细胞株PC-3,噻唑蓝(MTT)法检测辣椒素对前列腺癌细胞生长的影响,并筛选出最佳浓度用于后续实验;Western blot检测辣椒素对前列腺癌细胞增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1、p21;凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax;上皮-间质转变(EMT)标志物 E-cadherin、ZO-1、N-cadherin、Vimentin 以及 Wnt/β-catenin 信号通路 Wnt-2、p-GSK3β(Ser9)、β-catenin、及其下游靶点CyclinD1、c-Myc表达的影响。qPCR检测辣椒素对前列腺癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响;Hoechest染色法检测辣椒素干预对前列腺癌细胞凋亡的影响。细胞划痕法检测辣椒素干预前列腺癌细胞在不同时间段(0h、24 h、48 h)的划痕愈合率。收集对数生长期的PC-3细胞,混合基质胶接种于裸鼠腋窝皮下,建立裸鼠前列腺癌异种移植模型。分析辣椒素对肿瘤体重、肿瘤重量和肿瘤体积的影响,并采用HE染色法分析辣椒素对肿瘤组织细胞质和细胞核的影响。Western blot和qPCR检测辣椒素对肿瘤组织增殖相关蛋白PCNA、Cyclin D1、p21;凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax;EMT相关蛋白 E-cadherin、N-cadherin、ZO-1、Vimentin;Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin、p-GSK3β(Ser9)、c-Myc表达的影响。免疫组化法检测肿瘤组织PCNA和Bcl-2表达的改变以及 EMT 相关蛋白 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 和 Wnt/β-catenin 信号通路转导关键转录因子β-catenin及其靶基因c-Myc表达的改变。[结果]1.辣椒素抑制前列腺癌细胞的活力细胞贴壁培养法培养前列腺癌细胞PC-3,用不同浓度的辣椒素进行处理这些细胞5天,检测辣椒素对前列腺癌细胞发展活力的影响。与对照组进行比较后发现,辣椒素显可以抑制前列腺癌细胞的生长,并导致其形态学改变,胞体变圆脱落。此外,MTT结果显示,辣椒素在1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L时可明显降低前列腺癌细胞的活力(P<0.05),并具有一定程度的浓度依赖性。2.辣椒素抑制前列腺癌细胞增殖、凋亡和EMT进程用不同浓度的辣椒素处理前列腺癌PC-3细胞5天,蛋白质印迹法结果显示,与空白组比较,辣椒素在1 μmol/L、5μmol/L、10μmol/L时可明显诱导PC-3细胞增殖能力下降(P<0.05),具有促增殖作用的基因PCNA、CyclinD1蛋白水平被下调,抑制肿瘤细胞周期的基因p21蛋白水平被上调。且呈浓度依赖性。用不同浓度的辣椒素处理PC-3细胞5天,检测辣椒素对前列腺癌细胞凋亡的影响,Hoechest染色显微镜下观察发现,与空白组比较,辣椒素在1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L时可明显促进PC-3细胞的凋亡,细胞间隙变大,凋亡数量增多,5μmol/L和10μmol/L细胞核染色呈明显亮白色,染色质浓缩现象加重;Western blot和qPCR结果显示辣椒素主要以浓度依赖性方式下调细胞凋亡标志物Bcl-2的蛋白水平和mRNA,上调Bax的蛋白水平和 mRNA(P<0.05)。不同浓度的辣椒素处理前列腺癌细胞PC-3 5天,并作细胞划痕,划痕大小一致,显微镜下观察划痕面积的变化,与空白组比较,1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L辣椒素处理组划痕边缘清晰,细胞愈合速度明显变慢,且成浓度依赖性;Western blot结果显示辣椒素影响EMT相关标志物的表达,维持细胞稳定蛋白E-cadherin、ZO-1水平被上调,介导癌细胞相互作用蛋白N-cadherin和Vimentin水平被下调,且以浓度依赖性地方式(P<0.05)。3.辣椒素抑制前列腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路前列腺癌细胞PC-3培养于SSM中,于传代次日换液时加入不同浓度的辣椒素处理5天,每天换液给药,并收集蛋白,Western blot结果显示辣椒素干预前列腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路活性被降低,通路相关因子Wnt-2、p-GSK3β(Ser9)、β-catenin、CyclinD1、c-Myc 蛋白水平被下调(P<0.05)。4.前列腺癌裸鼠移植瘤模型的建立及辣椒素干预作用前列腺癌PC-3细胞贴壁培养2天后收集状态较好的部分传代继续培养扩增到需要的细胞数量,消化细胞,以1:1的比例混合基质胶制成细胞混悬液接种于裸鼠腋窝皮下组织,接种7-10天后即可见到肿瘤结节,辣椒素灌胃处理25天,与对照组相比,瘤体体积和瘤体重量均有所下降;HE染色结果可以看出肿瘤细胞分布较为分散,细胞之间粘附性较低,且形态不规则,呈现浸润生长,辣椒素处理组比空白对照组细胞凋亡数量明显增多。5.辣椒素抑制前列腺癌裸鼠移植瘤增殖、凋亡、EMT进程前列腺癌裸鼠移植瘤成瘤后辣椒素灌胃处理25天,Western blot和qPCR结果均显示,与空白组比较,辣椒素在50mg/kg、100mg/kg时可明显诱导组织中PC-3细胞活力增殖能力下降(P<0.05),下调肿瘤增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1,且呈浓度依赖性;免疫组化结果显示PCNA蛋白表达水平下降(P<0.05)。用不同浓度的辣椒素灌胃处理裸鼠25天,检测辣椒素对前列腺癌组织中细胞凋亡的影响,Western blot和qPCR结果显示辣椒素干预后细胞凋亡标志物Bcl-2的蛋白水平和mRNA水平被下调,Bax的蛋白水平和mRNA水平被上调(P<0.05);免疫组化结果显示Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.05)。不同浓度的辣椒素灌胃处理裸鼠25天,Western blot和qPCR结果显示辣椒素影响EMT相关标志物的表达,E-cadherin、ZO-1的蛋白水平和mRNA水平被上调,N-cadherin和Vimentin的蛋白水平和mRNA水平被下调,以浓度依赖性地方式(P<0.05);免疫组化结果显示,N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平下调,E-cadherin蛋白表达水平上调(P<0.05)。6.辣椒素抑制前列腺癌裸鼠移植瘤Wnt/β-catenin信号通路前列腺癌细胞PC-3培养于SSM中,收集细胞并接种到裸鼠腋窝皮下组织,成瘤后辣椒素干预25天。取出瘤体进行Western blot和qPCR检测,结果显示前列腺癌组织Wnt/β-catenin信号通路活性能够被辣椒素抑制,表现为通路相关因子β-catenin、CyclinD1、c-Myc等的蛋白水平和mRNA水平被下调(P<0.05)。免疫组化结果显示,β-catenin和c-Myc蛋白表达水平均下调(P<0.05)。[结论]1.血清贴壁培养法可以收集前列腺癌细胞并建立前列腺癌裸鼠移植瘤模型;2.辣椒素呈剂量依赖性地抑制前列腺癌细胞和裸鼠移植瘤的活力;3.辣椒素呈剂量依赖性地抑制前列腺癌细胞和裸鼠移植瘤的增殖能力;4.辣椒素呈剂量依赖性地促进前列腺癌细胞和裸鼠移植瘤的凋亡;5.辣椒素靶向于Wnt/β-catenin信号通路,下调前列腺癌活性和逆转前列腺癌细胞EMT进程。

rENE影像组学深度学习模型的构建及其对前列腺癌侵袭性的预测研究

这是一篇关于前列腺癌,淋巴结包膜外侵犯,Gleason评分,ISUP分级,磁共振成像,影像组学,深度学习的论文, 主要内容为第一部分rENE与前列腺癌病理分级的相关性研究目的:探究rENE与PCa病理分级的相关性,并评估rENE是否能独立预测PCa病理分级。方法:回顾性纳入西京医院2004年1月至2021年12月行盆腔MRI检查、病理确诊PCa且经RP并PLND术后病理确诊N1期(p N1)或MRI提示N1期(r N1)病例共2143例。依照已纳入第八版HNSCC AJCC TNM分期的rENE诊断标准,综合分析前列腺bp MRI影像,将病例分为rENE+组与rENE-组。其中rENE+组1505例,rENE-组638例。为保证研究可信度,使用κ值检验r N1与rENE各征象的阅片者间一致性;而后用Wilcoxon秩和检验分析rENE+组与rENE-组之间GS与ISUP分级分组的统计学差异;采用Spearman秩相关探索rENE与GS、ISUP分级的相关性;使用logistic回归评估rENE能否独立预测ISUP分级分组≥4的病例。结果:1.r N1与rENE征象判读及诊断的阅片者间一致性较好;2.p N1、r N1及全部病例中,rENE+组的GS和ISUP分级分组均高于rENE-组,差异有统计学意义(P<0.01);3.经Spearman秩相关性分析,p N1、r N1及全部病例中,GS、ISUP分级分组与rENE均正相关,相关系数分别为0.57、0.53,0.56、0.53及0.45、0.41;4.全部病例、p N1组及r N1组病例的单因素及多因素回归分析均提示rENE、T分期及t PSA为ISUP分级分组≥4的独立预测因素,且rENE的预测效能最高。结论:在PCa病例中,rENE与GS、ISUP分级分组正相关;相较于rENE-患者,rENE+患者的原发灶恶性程度更高,侵袭性更强。rENE可作为ISUP分级分组≥4的独立预测因素。第二部分rENE影像组学模型的构建及其对前列腺癌侵袭性的预测研究目的:为减少rENE诊断的阅片者间差异,构建rENE的影像组学模型,并评估该模型对PCa侵袭性的预测效能。方法:回顾性纳入西京医院2017年1月1日至2022年6月30日进行盆腔MRI检查、病理确诊PCa,p N1或r N1患者共160例。由两名影像医师依照HNSCC AJCC TNM分期的rENE诊断标准,综合分析bp MRI序列,将纳入病例分为rENE+110例与rENE-50例。用随机数表法按7∶3的比例分别将p N1、r N1组病例均随机分成训练集与验证集,而后合并同名数据集。最终得到训练集112例(rENE+77例、rENE-35例)和验证集48例(rENE+33例、rENE-15例)。首先采用Wilcoxon秩和检验及Mann-Whitney U检验对比训练集与验证集之间、rENE+与rENE-组之间的年龄、T分期、t PSA、ISUP分级及GS等基线资料差异,确保无病例选择偏倚。图像处理分两步:先使用3D slicer软件进行图像分割;再使用FEA软件进行影像组学特征(radiomics feature,RF)的提取、标准化、筛选及建模。其中,RF标准化使用均一化与Z评分2种方法进行;而后使用方差分析及F值进行排序;最后使用SVM、RF、RFE、LDA、AE、LR、Lasso regression、Adaboost及NB等8种分类器建模,共计建模320个,并采用5折交叉验证。评估各影像组学模型的诊断效能使用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线和曲线下面积(area under curve,AUC),综合分析验证集、交叉验证集AUC值与模型稳定性筛选最优影像组学模型。使用ROC曲线评估影像组学模型在训练集、验证集及全部病例中对ISUP分级分组≥4的预测效能。使用logistic回归探究ISUP分级分组≥4的独立预测因素。本研究P值取双尾,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.在构建的320个组学模型中,选取验证集中AUC值最高且稳定性最好的ZscorePCCANOVA2NB模型。该模型由2个特征组成,在训练集、验证集及交叉验证集中,该模型诊断rENE的AUC值分别为0.954、0.952和0.960;2.在训练集、验证集及全部病例中,影像组学模型预测ISUP分级分组≥4的AUC值分别为0.862、0.944和0.923;3.多因素logistic回归分析提示ISUP分级分组≥4的独立预测因素分别为ZscorePCCANOVA2NB影像组学模型与t PSA。结论:rENE影像组学模型的构建减少了阅片者间差异,可用于无创、定量预测PCa侵袭性。第三部分基于卷积神经网络构建rENE深度学习模型的研究目的:基于CNN构建rENE DL模型以减少rENE诊断的阅片者间差异。方法:纳入病例与第二部分相同。经两名影像医师共同分析bp MRI序列后,将病例分为rENE+与rENE-组。先使用3D slicer软件对图片进行分割,而后使用Py Charm搭载Python 3.8编写程序,进行图片预处理及DL模型建立。为保证所有影像资料的分辨率统一,选取spacing的中值大小(0.4,0.4,4.5)进行重采样;而后利用Z-评分正则化所有像素,以保证像素正态分布。引入Py Torch 1.4工具,构建LGA模块、SCL模块及LL模块进行病灶区域的学习、特征提取及DL模型的整体构建。使用F1分数评估模型的精准度;使用ACC、SPE、SEN及AUC值评估模型对rENE的诊断效能。结果:使用CNN算法构建rENE的诊断模型ENE-Net。该模型对rENE诊断的效能较好,F1分数、ACC、SPE、SEN及AUC分别为0.909±0.052、0.762±0.383、0.922±0.045及0.960±0.041。结论:rENE的DL模型ENE-Net可很好的评估rENE,减少了阅片者间差异,未来可进一步收集病例完成迭代。

载STEAP-1抗体前列腺癌靶向超声微泡的制备及寻靶实验研究

这是一篇关于前列腺跨膜上皮1抗原,靶向超声微泡造影剂,前列腺癌,生物素-亲和素,超声造影的论文, 主要内容为目的:采用生物素-亲和素法制备载前列腺跨膜上皮抗原-1(Six-transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate,STEAP)抗体的新型靶向超声微泡,检测其结合率、稳定性及体外寻靶能力;通过荷人前列腺癌移植瘤裸鼠超声增强显影来检测载STEAP-1抗体靶向微泡的体内寻靶能力。方法:(1)体外培养人前列腺癌细胞LNCa P和PC3,分别采用免疫荧光法定性检测和Western blot法半定量检测STEAP-1在两种前列腺癌细胞中的表达情况;(2)采用生物素-亲和素法将STEAP-1抗体与普通声诺维微泡牢固结合,显微镜下观察靶向微泡荧光情况,并通过流式检测其结合率与稳定性;(3)将所制备的靶向微泡与细胞爬片充分孵育反应,检测其体外结合能力;(4)建立荷人前列腺癌移植瘤裸鼠模型,分别利用靶向微泡、普通声诺维微泡对裸鼠进行超声增强显影,实时观察移植瘤的造影剂灌注情况、分布特征,并采用Contrast Dynamic定量分析软件对时间-强度曲线(Time-intensity Curve,TIC)进行分析,获取峰值强度(Peak Intensity,PI)、达峰时间(Time to Peak,TTP)、曲线下面积(Area under the Curve,AUC)及平均渡越时间(Mean Transit Time,MTT)。结果:(1)荧光显微镜下观察,视野内两种前列腺癌细胞表面均发出绿色荧光,即呈阳性表达;Western blot实验结果显示,LNCa P细胞中STEAP-1呈相对高水平表达。(2)载STEAP-1抗体靶向微泡涂片后于荧光显微镜下观察,微泡表面见呈现环状绿色荧光,而普通对照组在镜下视野丢失;流式分析检测显示,所制备的靶向微泡大小均一,结合率明显高于同型对照组,差异有统计学意义(p<0.05),震荡后结合率略小于震荡前,但差异无统计学意义(p>0.05)。(3)靶向微泡与前列腺癌细胞孵育反应后,出现微泡向细胞区域聚集的现象;PBS缓冲液冲洗后,靶向微泡于细胞周边呈花环状粘附,LNCa P细胞的粘附率高于PC3细胞,差异有统计学意义(p<0.05);PBS缓冲液再次冲洗,两种细胞的前、后粘附率比较均显示差异无统计学意义(p>0.05)。(4)分别经尾静脉注射靶向微泡、普通微泡,均见移植瘤组织回声逐渐增强,达一定程度后逐渐减弱,靶向微泡、普通微泡的PI、AUC、MTT有显著差异(p<0.05),前者相对高于后者,而TTP无差异(p>0.05)。LNCa P移植瘤与PC3移植瘤相比,PI、AUC有差异(p<0.05),前者相对高于后者,而TTP、MTT无差异(p>0.05)。结论:(1)STEAP-1蛋白在人前列腺癌细胞LNCa P和PC3中均呈阳性表达,且前列腺癌分化早期代表细胞株LNCa P细胞呈相对高水平表达;(2)载STEAP-1抗体的新型靶向微泡可经生物素-亲和素法成功制备,STEAP-1抗体与普通微泡的结合率高且稳定性较好;(3)载STEAP-1抗体靶向微泡体外寻靶时可与人前列腺癌细胞牢固结合,且LNCa P细胞较PC3细胞结合率高;(4)载STEAP-1抗体靶向微泡在荷人前列腺癌移植瘤裸鼠体内的寻靶特异性较高且靶向性好,说明STEAP-1可作为超声靶向造影的理想靶点之一,具备一定的基础研究和临床应用价值。