家蚕二化性品种不同处理蚕卵胚胎早期糖代谢相关酶的活性分析

这是一篇关于家蚕,胚胎,滞育,糖代谢,基因表达,酶活性,转录本的论文, 主要内容为家蚕Bombyx mori是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物,也是典型的卵滞育的昆虫。长期以来,家蚕的滞育受到人们重视,做了大量的研究,但是滞育分子机制还不完全明了。家蚕滞育的发动和解除伴随着大量的代谢活动,其中包括糖代谢,有研究表明滞育卵和非滞育卵中糖代谢相关酶的活性存在明显的差异。家蚕二化性品种子代蚕卵的滞育性受亲代胚胎期环境条件的调控,胚胎期20℃以上长日照则子代为滞育命运卵(diapause-destined eggs,DD),盐酸浸渍处理可以打破滞育;胚胎期15℃以下短日照则子代为非滞育卵(non-diapause-destined eggs,ND)。那么,蚕卵胚胎期糖代谢相关酶蛋白与滞育存在怎样的关联呢?为此,我们以家蚕二化性品种“秋丰”活化越年蚕卵为材料,在RNA和蛋白质水平探讨家蚕二化性品种胚胎发育早期卵内糖代谢相关酶的表达水平与其滞育性的关系,取得以下主要研究结果。1、家蚕糖代谢相关酶的生物信息学分析运用Swiss MODEL软件,预测了家蚕糖代谢相关的己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)三种酶的蛋白质结构;MEGA 6.0软件分析了HK、PK和PFK在家蚕和其他10多个物种间的进化情况,结果显示,Bm HK与野蚕HK的一个拷贝聚类在一起,说明系统分类上同源性近;Bm PK与金凤蝶PK、柑橘凤蝶聚PK聚在一个分支上,说明亲缘关系较近;Bm PFK与Bm PFK另一拷贝(XP012549268.1)及野蚕PFK聚在同一分支,说明亲缘关系较近。2、家蚕糖代谢相关酶的RNA表达水平分析以“秋丰”活化越年蚕卵为材料进行25℃明催青和17℃暗催青,分别制备滞育命运卵(DD)和非滞育命运卵(ND),并取一部分滞育命运卵在产卵后20 h进行即时浸酸处理(以此为计时起点),得到即时浸酸卵(immediately acid treated eggs,IA)。对3种蚕卵在0、2、6、12、24、48、72和96 h分别取样,-80℃保存备用。利用q RT-PCR技术分别测定3种家蚕卵中与糖代谢相关的己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、磷酸丙糖异构酶(triosephosphate Isomerase,TPI)、海藻糖酶(trehalase,TRE)、山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)、葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GCDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate,PEPCK)这8种酶基因RNA的表达水平。结果显示:在测定的96 h内,糖酵解相关酶基因Bm HK、Bm PK、Bm PFK、Bm TPI,磷酸戊糖途径相关酶基因Bm GCDH和其他代谢途径相关酶基因Bm SDH、Bm TRE在ND组和IA组中的表达水平普遍高于DD组,糖异生相关酶基因Bm PEPCK在DD组中的表达水平普遍高于ND组和IA组。3、家蚕糖代谢相关酶的活性分析利用紫外可见分光光度法分别测定3种家蚕卵中与糖代谢相关的HK、PK、PFK、TPI、TRE、SDH、GCDH、PEPCK这8种酶的酶活性。结果显示:在测定的96 h内,糖酵解相关酶Bm HK、Bm PK、Bm PFK、Bm TPI,磷酸戊糖途径相关酶Bm GCDH和其他代谢途径相关酶Bm SDH、Bm TRE在ND组和IA组中的酶活性普遍高于DD组,糖异生相关酶Bm PEPCK在DD组中的酶活性普遍高于ND组和IA组,与RNA水平分析结果一致。4、Bm HK基因结构及胚胎发育早期表达特性分析从NCBI网站查阅到Bm HK基因的4个转录本信息,分别为Bm HK-a、Bm HK-b、Bm HK-c、Bm HK-d。利用4个转录本的特异序列进行引物设计,通过q RT-PCR技术分别测定其在3种蚕卵中的表达水平。结果显示,在测定的96 h内,各转录本的表达水平呈现出阶段性变化的特征,在同一时间点的同种蚕卵中Bm HK-a的表达水平高于其余3个转录本,说明Bm HK-a在Bm HK基因发挥功能方面所起影响作用较大。综上所述,DD组因胚胎滞育的需要,胚胎发育早期卵内糖代谢以能量和物质的贮存为主;而ND组和IA组由于胚胎发育进程较快,糖代谢以物质分解代谢为主。该研究结果初步揭示了家蚕卵内糖代谢与滞育的关系,有助于更好地理解家蚕滞育的分子机制。

5-HTT、NET、BDNF和IDO表达调控和皮质酮的关系

这是一篇关于抑郁,基因表达,海马神经元,皮质酮,丙戊酸钠的论文, 主要内容为目的：探讨皮质酮是否通过其受体介导原代培养的大鼠海马神经元5-HTT、NET、BDNF和IDO的表达；探讨丙戊酸钠是否干扰皮质酮对原代培养的大鼠海马神经元5-HTT、NET、BDNF和IDO的表达调控。方法：1.采用孕期为18天的SD胎鼠培养原代海马神经元。免疫组织化学的方法鉴别海马神经元的纯度。2.MTT比色法检测皮质酮对海马神经元损伤作用的浓度-效应曲线和时间-效应曲线。3.RT-PCR方法和Western-blot法分别检测海马神经元5-HTT、 NET、BDNF和IDO mRNA及蛋白表达。4.检测皮质酮对海马神经元5-HTT、NET、BDNF和IDO mRNA及蛋白表达的影响以及这种影响与皮质酮受体的关系。5.检测丙戊酸钠是否干扰皮质酮对海马神经元5-HTT、NET、BDNF和IDO mRNA及蛋白表达的调控。结果：1.原代培养的海马神经元纯度超过90%,具有良好的外观和功能。2.MTT结果显示,皮质酮呈时间和浓度依赖性降低海马神经元存活率：5μmol/L的皮质酮作用于海马神经元24h和1μmol/L作用48h均显示细胞存活率明显降低。1 μmol/L以下浓度的皮质酮对原代海马神经元没有显著作用。3.RT-PCR结果显示,皮质酮能诱导海马神经元BDNF mRNA表达显著降低,IDO mRNA表达显著升高。这种升高可以被米非司酮翻转,但丙戊酸钠对这种升高无显著影响。皮质酮对单胺转运体mRNA表达没有显著性作用。4.Western-blot结果显示,皮质酮能诱导海马神经元BDNF表达显著降低,IDO表达显著升高,这种升高可以被米非司酮翻转,但丙戊酸钠对这种升高无显著影响。皮质酮对于单胺转运体表达没有显著性作用。结论：1.皮质酮诱导海马神经元BDNF表达降低,IDO表达的升高,而对5-HTT和NET的表达没有影响。2.皮质酮诱导海马神经元BDNF表达降低和IDO表达升高主要是通过激动皮质酮受体而发挥作用。3.丙戊酸钠不能翻转皮质酮诱导的海马神经元BDNF表达降低和IDO表达升高。

外源甲基睾酮对不同发育时期蚂蟥生长以及性腺发育的影响

这是一篇关于蚂蟥,生长,性腺发育,性类固醇激素,基因表达的论文, 主要内容为蚂蟥(Whitmania paigra Whitman),又名宽体金线蛭,其干燥全体为中国药典(2015)中药材水蛭,具有破血通经,逐淤散结的功效。蚂蟥为同步性雌雄同体动物,精巢先于卵巢发育,精卵有序发育同步成熟。生殖细胞的增殖、形成和成熟主要与精(卵)巢中雄、雌激素的参与有关,甲基睾酮(MT)作为一种重要的雄性激素,不仅影响性腺发育,还具有促进动物生长的功能。因此本实验拟在蚂蟥精巢增殖期(卵巢形成期)、精巢休眠期(卵巢生长期)两个时期的养殖水体中添加不同浓度甲基睾酮(MT),从组织、生理、分子层面研究外源MT对蚂蟥生长和性腺发育的影响,结果可为蚂蟥生殖发育机理的研究提供理论依据,同时可为蚂蟥人工养殖提供指导。研究结果如下:(1)研究外源MT对不同时期蚂蟥生长、性腺发育的影响。用0.1μg·L-1、1.0μg·L-1、10.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1、150.0μg·L-1共5个浓度MT对1.5月龄和5.5月龄蚂蟥分别进行水浴处理6周,同时对部分5.5月龄MT处理6周的蚂蟥进行60天自然冬眠,采用称重法测定这三个时期蚂蟥体重、性腺指数和内在品质;采用组织切片和HE染色技术,观察蚂蟥精卵细胞的发育。结果表明,外源MT在0.1～150.0 μg·L-1时能不同程度促进蚂蟥生长和性腺发育,其促进程度随MT浓度的升高呈先升高后降低趋势。其中,1.5月龄蚂蟥添加MT100.0μg·L-1时特定生长率最高,10.0 μg·L-1时性腺指数最高;5.5月龄蚂蟥添加MT6 10.0μg·L-1时特定生长率最高,100.0 μg·L-1时性腺指数最高;自然越冬后蚂蟥,MT100.0μg·L-1体重时最高,10.0 μg·L-1时雄性腺指数最高,1.0 μg·L-1时雌性腺指数最高,药材品质均符合《中国药典》(2015年版)标准,抗凝血酶活性均高于对照组。当外源MT浓度升高至10.0 μg·L-1时3月龄蚂蟥精巢中开始提前出现初级、次级精母细胞,卵巢内出现卵原细胞;MT为100.0 μg·L-1时,7月龄和9月龄性腺内精母细胞、精细胞、卵母细胞数量显著高于其他浓度和未添加组。(2)研究外源MT对不同时期蚂蟥内源性类固醇激素的影响。结果表明,1.5月龄蚂蟥添加MT6周后,内源睾酮(T)、雌三醇(E3)和黄体酮(P)随外源MT浓度的升高呈先升高再降低趋势,其中T、E3和P分别在浓度为100.0μg·L-1、1.0 μg·L-1.0μg·L-1时最高(P<0.05);甲基睾酮(MT)、雌酮(E1)与外源MT浓度呈正相关。5.5月龄蚂蟥添加MT6周后,内源T、E1、E3与外源MT浓度呈正相关;MT和P随外源MT浓度升高呈先升高再降低趋势,100.0 μg·L-1时最高(P<0.05)。自然越冬蚂蟥各激素均呈先升高再降低趋势,T、MT、P在100.0μg·L-1时最高,E1在1.0μg·L-1时最高、E3在10.0 μg·L-1时最高。经外源MT处理后内源T/E3、T/E1均低于对照组。(3)研究外源MT对不同时期蚂蟥内源性类固醇激素相关基因表达的影响。结果表明:随外源MT浓度升高,生长激素基因(GH)、胰岛素样生长因子-1基因(IGF-1)、芳香化酶α(CYP19α)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)和FOXL2基因均呈先升高后降低趋势,基本在浓度10.0～100.0μg·L-1范围内上调显著(p<0.05);SRY基因在雄性腺中上调显著(p<0.05),雌性腺中表达不显著(p>0.05);WNT4基因在雄性腺中表达不显著(p>0.05),在雌性腺中上调显著(p<0.05)。在雄性腺内,随外源MT浓度升高,SRY/WNT4均高于CK组并呈先升高再降低趋势,处理1.5和5.5月龄蚂蟥在10 μg·L-1时最高,分别为2.06和4.29,自然越冬蚂蟥在100μg·L-1时最高,为2.84;在雌性腺内,随外源MT浓度升高,SRY/WNT4均低于CK组并呈先降低再升高趋势,处理1.5和5.5月龄蚂蟥在浓度为10μg·L-1时最低,分别为0.15和0.32,自然越冬蚂蟥在浓度为100 μg·L-1时最低,为0.25。

扬子鳄GHR、IGF-1R、IGF-2和IGF-2R的分子结构特征及在冬眠期和活动期的时空表达变化

这是一篇关于扬子鳄,生长轴,分子克隆,分子结构,基因表达的论文, 主要内容为扬子鳄(Alligator sinensis)属爬行纲鳄目鼍科,是我国特有的鳄类,因其野生种群数量稀少,已被列为国家一级保护动物。扬子鳄的皮革用途广,肉质鲜美并具有药用价值,还可作为观赏动物,故人工养殖可带来较高的经济效益。但扬子鳄属小型鳄,体长仅有大型鳄的1/3左右,且生长速度缓慢,这导致扬子鳄的人工养殖周期较长,养殖成本偏高,因而扬子鳄的快速生长养殖技术一直倍受广大鳄类养殖者关注和期待。内分泌生长轴对脊椎动物的生长起重要的调控作用,但目前对扬子鳄生长的内分泌调控机制知之甚少。本研究首次对扬子鳄生长轴上关键基因(GHR、IGF-1R、IGF-2和IGF-2R)的分子结构特征进行了分析,并通过荧光定量PCR技术分别比较了这四个基因在冬眠期和活动期的时空表达变化。扬子鳄生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)的cDNA全序列包含一个236bp的5’-非编码区(5’-UTR),一个325bp的3’-非编码区(3’-UTR)和一个1848bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。ORF共编码615个氨基酸,分为信号肽和成熟肽两段,分别含18和597个氨基酸。成熟肽由胞外区(221个氨基酸)、胞内区(352个氨基酸)和跨膜区(24个氨基酸)三部分组成。相似性比对分析表明,扬子鳄GHR与密西西比鳄的相似性最高(99%),与龟类(约82%)和鸟类(71%-81%)的相似性较高。进化树分析显示鳄类与鸟类亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,扬子鳄GHR在所检测的11个组织中都有表达。在活动期,肠的GHR mRNA表达量最高,肌肉和肝脏其次,其他组织中表达量较低。冬眠期,心脏、脾、肺、肾、胃、卵巢和肌肉中GHR的表达量极显著增加(P<0.01),但肠的表达量极显著减少(P<0.01),胰、肝脏和输卵管中无明显变化。GHR mRNA在活动期和冬眠期的表达变化表明,GHR可能对扬子鳄的消化和生长起到重要的调控作用。扬子鳄胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)cDNA序列全长为4681bp,包括一个69bp的5’-UTR,一个523bp的3’-UTR和一个4089bp的ORF。ORF编码一条含1363个氨基酸残基的多肽链,分为α和β两个亚基,α亚基包含一个由30个氨基酸组成的信号肽,一个保守的多半胱氨酸区和11个潜在的N-糖基化位点;β亚基包含一个跨膜域,一个酪氨酸激酶结构域和一个羧基末端。多序列比对结果发现扬子鳄IGF-1R与密西西比鳄的相似性最高,其次为鸟类。进化树分析显示鳄类与鸟类亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,扬子鳄IGF-1R在所测的11个组织中都表达。在活动期,扬子鳄肌肉中的IGF-1R表达量最高,心脏、卵巢、输卵管和肾中表达量较高,胰、肺和小肠较低,肝脏、脾和胃中最低。冬眠期,心脏和肌肉中IGF-1R表达量极显著增加(P<0.01),肾中表达显著增加(P<0.05)。IGF-1R的时空表达变化表明其对扬子鳄的生长和多种器官的代谢活动起重要调节作用。扬子鳄成熟的胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)由67个氨基酸残基组成,含B-C-A-D四个结构域。IGF-2R由2469个氨基酸残基组成,可分为信号肽、跨膜区、胞内区和胞外区四部分。对不同物种IGF-2及其受体氨基酸序列进行多序列比对,结果表明扬子鳄与其他爬行类一致性最高,其次为鸟类。进化树分析表明鳄类与鸟类亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,扬子鳄IGF-2及其受体在所检测的11个组织中都有表达。活动期,扬子鳄的IGF-2在肾和肝脏的表达量最高,其次为胰、卵巢、心脏、脾和肌肉,在输卵管、肠、肺和胃中表达量较少。冬眠期,肺、肾、胃和胰中IGF-2的表达量极显著降低(P<0.01),在肝和肌肉中的表达量显著降低(P<0.05),其他组织无显著变化。活动期,IGF-2R在脾和胃中表达量最高,其次为肾、胰和肌肉,在其他组织中表达量较少。冬眠期,脾、肺、肾、胃、肠和胰的IGF-2R的表达量极显著降低(P<0.01),心脏和肌肉的表达量极显著增加(P<0.05),其他组织无显著变化。IGF-2及其受体表达量的变化表明其对扬子鳄的生长和多种器官的代谢活动起重要调节作用。本研究不仅加深了对生长轴关键基因(GHR、IGF-1R、IGF-2和IGF-2R)的分子结构进化的认识,而且增进了对扬子鳄内分泌调控机制的了解,为发展扬子鳄的快速生长养殖技术提供了基础资料。

家蚕山梨醇脱氢酶基因的时空特异表达及启动子特性分析

这是一篇关于家蚕,滞育,山梨醇脱氢酶,基因表达,半定量RT-PCR,启动子的论文, 主要内容为山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）是山梨醇转化为糖原的关键酶。家蚕有3个SDH基因，即BmSDH-1、BmSDH-2a和BmSDH-2b，均位于家蚕第21号染色体。家蚕卵中山梨醇含量的变化与卵期滞育的发动、持续和停止有着密切的平行关系。以往的研究集中于BmSDH在卵期的表达及酶活情况，对于家蚕其它时期和组织的表达的研究较少，也未见BmSDH启动子特性分析。 本论文在生物信息学分析BmSDH-1、BmSDH-2a和BmSDH-2b基因的结构、同源性以及蛋白质结构的基础上，用RT-PCR的方法分析了3个BmSDH基因的时空表达特性，比较了25℃明催青和17.5℃暗催青两种不同催青条件对家蚕后期BmSDH表达的影响；克隆了BmSDH-2a启动子片段，分析了其转录特性。 1. BmSDH的生物信息学分析 BmSDH-1基因全长6.035kb，由8个外显子7个内含子构成；BmSDH-2a基因全长10.75kb，由6个外显子5个内含子构成；BmSDH-2b基因全长约10.15kb，由8个外显子7个内含子构成。一级结构分析显示BmSDH-1与BmSDH-2a，BmSDH-2b之间的相似度均为49.7%，BmSDH-2a和BmSDH-2b的相似度为96.4%。用MEGA4.0软件构建了BmSDH-1，-2a和-2b与其他13个物种（包括昆虫、两栖类、哺乳和人类）基于同源蛋白氨基酸序列的系统进化树，结果显示BmSDH-1独立成一个亚支，BmSDH-2a和-2b属于同一个分支，它们与蜜蜂、熊蜂以及印度跳蚁等昆虫的亲缘关系较近。 2. BmSDH基因时空表达特性分析及不同催青条件对表达的影响 根据家蚕二化性品种子代滞育性受亲代胚胎期催青条件调控的原理，即25℃明催青则子代卵滞育，而20℃以下低温暗催青则子代卵为非滞育。以二化性品种“秋丰”越年活化卵为材料，采用蛾区半分法，分别用25℃明催青和17.5℃暗催青处理，孵化后25℃常规方法桑叶饲养，羽化后同一处理内的雌雄蛾交配制种。利用半定量RT-PCR的方法，分析不同发育时期的雌性蚕体及不同组织中BmSDH转录水平，以及25℃明催青和17.5℃暗催青对BmSDH转录水平的影响。结果显示BmSDH-1、BmSDH-2a和BmSDH-2b在“秋丰”品种的各个发育阶段均有表达；在幼虫期5龄3d，BmSDH-1在常温明催青组脂肪体中转录水平较高，BmSDH-2a和BmSDH-2b在常温明催青条件下的血液、脂肪体和卵巢中转录水平均高于低温暗催青处理组；在蛹期3d，BmSDH-2a和BmSDH-2b在常温明催青条件下血液和卵巢中的转录水平均低于低温暗催青处理组；在次代卵产下后6～24h期间，BmSDH-1的转录水平较低且没有明显变化；而BmSDH-2a和BmSDH-2b的转录水平逐渐升高，但是2个基因的转录水平在不同催青处理中未见明显变化。说明BmSDH-1和蚕卵滞育与否没有直接关系，而BmSDH-2a和BmSDH-2b与家蚕二化性品种卵滞育与否有重要的平行关系。 3. BmSDH-2a基因启动子的克隆和特性分析 根据家蚕基因组中BmSDH-2a基因上游启动子区域的核苷酸序列，分别设计2个上游和1个下游引物，以5龄后部丝腺基因组DNA为模板，用PCR方法克隆BmSDH-2a基因上游674bp和355bp的启动子片段BmSDH-2aP-674、BmSDH-2aP-355。在线软件预测分析显示，克隆的674bp长度片段含有核心启动子区，其中包括TATA-盒和GC盒，以及一些与胚胎发育相关的转录因子结合位点，如GATA-1、HSF1、CREB、CdxA、cap和Oct-1等，其中后4个多次出现。以pGL3.0basic为载体，萤火虫荧光素酶基因luciferace（luc）为报告基因，分别构建不同长度BmSDH-2a启动子控制的报告质粒pGL-BmSDH-2aP-674-luc,pGL-BmSDH-2aP-355-luc；分别转染家蚕BmN细胞，以转染pGL3.0basic-luc的细胞为对照，72h后收集细胞，在LuminoMeter20/20荧光光度计上测定荧光素酶活性。结果显示，2个不同长度BmSDH-2a启动子片段均有活性，674bp启动子的活性是355bp的2.4倍，说明在BmSDH-2a启动子区的-355到-674nt片段可能存在正调控元件。 上述研究析结果，为阐明家蚕滞育的分子机制积累了新的实验数据。