12种拟步甲科昆虫生物学特性研究（鞘翅目）

这是一篇关于鞘翅目,拟步甲科,生物学特性的论文, 主要内容为拟步甲是地球上分布广、种类多、形态和生活类型极富多样性的一类甲虫,该科昆虫与农、林、牧和仓储物关系密切,部分种类为重要资源昆虫。因此,研究其生物学有重要理论和实践意义。荒漠半荒漠地区是拟步甲的主要分布地区,其生物学研究难度大,但对该地区昆虫资源的开发和草原害虫的防治意义也大。本文在历时三年野外观察、采集和室内饲养的基础上,对分布于我国蒙新区荒漠半荒漠地区的4族9属12种拟步甲科昆虫的形态学和生物学特征进行了研究,其中,生物学特性部分为首次报道。形态学部分主要对成虫、卵、幼虫、蛹的形态特征进行了描述,生物学特性部分从各虫态发育历期、各龄幼虫发育历期、生活史和生活习性四方面进行了研究。文中附表39个、形态特征图202幅。论文共分七章。 1 引言部分介绍了昆虫生物学的研究内容及研究其目的和意义以及拟步甲科在分类、饲养、生活史、生活习性等方面的研究现状。 2 介绍了研究材料、标本的采集和保存、采集记录和饲养记录、研究方法、室内饲养方法、生物学特性观察方法等。 3 漠甲族和多毛宽漠甲、洛氏脊漠甲、莱氏脊漠甲、突角漠甲四种昆虫的生物学特性。 4 砚甲族和中华砚甲的生物学特性。 5 琵甲族和弯齿琵甲、异距琵甲、戈壁琵甲三种昆虫的生物学特性。 6 土甲族和类沙土甲、阿笨土甲、网目土甲、波氏真土甲四种昆虫的生物学特性。 7 根据本文研究结果,结合导师课题组的前期研究积累,对该科9族14属19种昆虫的生活史、各虫态发育历期、幼虫虫龄进行了比较,并对它们的天敌、食性、防御性、活动节律、群集性、生殖行为和成虫寿命及性比等进行了简要的归纳和总结。结果表明: (1)漠甲族四种昆虫1～3年完成1代,多毛宽漠甲2年或3年完成1代;洛氏脊漠甲1年完成1代;莱氏脊漠甲2年完成1代;突角漠甲3年完成1代。除洛氏脊漠甲以幼虫越冬外,其余三种均以成、幼虫越冬。幼虫6～9龄。越冬幼虫于5月下旬至9月上旬化蛹。除洛氏脊漠甲经10～13天性成熟,当年即可交配产卵,其余三种于次年4月上旬至9月中旬交配产卵。 (2)砚甲族的中华砚甲2年完成1代,以成、幼虫越冬,幼虫7龄,越冬幼虫6月上旬至8月上旬化蛹,羽化成虫于次年性成熟,3月下旬至10月上旬交配产卵。成虫喜洞栖,有群集性;幼虫不活跃。 (3)琵甲族三种昆虫2年完成1代;以成、幼虫越冬;幼虫11～12龄;越冬幼虫6月下旬至9月上旬化蛹;羽化成虫于次年性成熟,3月下旬至10月上旬交配产卵。成虫有群集、化学防御和储存食物等习性;幼虫有自相残杀习性。 (4)土甲族四种昆虫1年完成1代,以成虫越冬,越冬成虫于次年初春开始活动,4～6月交配产卵,幼虫期较短,1～5月,幼虫5～7龄,老熟幼虫当年6月上旬至10月上旬化蛹;羽化成虫当年不能交配产卵。成虫有假死性、化学防御性及群集性等。 所有研究材料保存于宁夏大学农学院标本室。

12种拟步甲科昆虫生物学特性研究（鞘翅目）

这是一篇关于鞘翅目,拟步甲科,生物学特性的论文, 主要内容为拟步甲是地球上分布广、种类多、形态和生活类型极富多样性的一类甲虫,该科昆虫与农、林、牧和仓储物关系密切,部分种类为重要资源昆虫。因此,研究其生物学有重要理论和实践意义。荒漠半荒漠地区是拟步甲的主要分布地区,其生物学研究难度大,但对该地区昆虫资源的开发和草原害虫的防治意义也大。本文在历时三年野外观察、采集和室内饲养的基础上,对分布于我国蒙新区荒漠半荒漠地区的4族9属12种拟步甲科昆虫的形态学和生物学特征进行了研究,其中,生物学特性部分为首次报道。形态学部分主要对成虫、卵、幼虫、蛹的形态特征进行了描述,生物学特性部分从各虫态发育历期、各龄幼虫发育历期、生活史和生活习性四方面进行了研究。文中附表39个、形态特征图202幅。论文共分七章。 1 引言部分介绍了昆虫生物学的研究内容及研究其目的和意义以及拟步甲科在分类、饲养、生活史、生活习性等方面的研究现状。 2 介绍了研究材料、标本的采集和保存、采集记录和饲养记录、研究方法、室内饲养方法、生物学特性观察方法等。 3 漠甲族和多毛宽漠甲、洛氏脊漠甲、莱氏脊漠甲、突角漠甲四种昆虫的生物学特性。 4 砚甲族和中华砚甲的生物学特性。 5 琵甲族和弯齿琵甲、异距琵甲、戈壁琵甲三种昆虫的生物学特性。 6 土甲族和类沙土甲、阿笨土甲、网目土甲、波氏真土甲四种昆虫的生物学特性。 7 根据本文研究结果,结合导师课题组的前期研究积累,对该科9族14属19种昆虫的生活史、各虫态发育历期、幼虫虫龄进行了比较,并对它们的天敌、食性、防御性、活动节律、群集性、生殖行为和成虫寿命及性比等进行了简要的归纳和总结。结果表明: (1)漠甲族四种昆虫1～3年完成1代,多毛宽漠甲2年或3年完成1代;洛氏脊漠甲1年完成1代;莱氏脊漠甲2年完成1代;突角漠甲3年完成1代。除洛氏脊漠甲以幼虫越冬外,其余三种均以成、幼虫越冬。幼虫6～9龄。越冬幼虫于5月下旬至9月上旬化蛹。除洛氏脊漠甲经10～13天性成熟,当年即可交配产卵,其余三种于次年4月上旬至9月中旬交配产卵。 (2)砚甲族的中华砚甲2年完成1代,以成、幼虫越冬,幼虫7龄,越冬幼虫6月上旬至8月上旬化蛹,羽化成虫于次年性成熟,3月下旬至10月上旬交配产卵。成虫喜洞栖,有群集性;幼虫不活跃。 (3)琵甲族三种昆虫2年完成1代;以成、幼虫越冬;幼虫11～12龄;越冬幼虫6月下旬至9月上旬化蛹;羽化成虫于次年性成熟,3月下旬至10月上旬交配产卵。成虫有群集、化学防御和储存食物等习性;幼虫有自相残杀习性。 (4)土甲族四种昆虫1年完成1代,以成虫越冬,越冬成虫于次年初春开始活动,4～6月交配产卵,幼虫期较短,1～5月,幼虫5～7龄,老熟幼虫当年6月上旬至10月上旬化蛹;羽化成虫当年不能交配产卵。成虫有假死性、化学防御性及群集性等。 所有研究材料保存于宁夏大学农学院标本室。

恶性胶质瘤细胞系的建立及其肿瘤干细胞生物学特性的初步研究

这是一篇关于恶性胶质瘤,细胞系,肿瘤干细胞,生物学特性,细胞培养,动物模型的论文, 主要内容为脑肿瘤是成人危害性极大的恶性肿瘤之一，儿童因肿瘤而死亡的主要肿瘤类型，发病率和死亡率不断升高，严重的威胁着人类的健康和生命。在过去25年里，原发恶性脑肿瘤病人一直在增加，尤其在中年人以每年1.2％的速率在增加。2006年，在美国约有18120个新发脑肿瘤病人，其中约12820个死亡。多形性胶质母细胞瘤(gliobastona multiforme，GBM)，颅内肿瘤分类属星形细胞瘤Ⅲ-Ⅳ级，是最常见的颅内原发肿瘤之一，约占成人因肿瘤而死亡总人数的2.3％。多形性胶质母细胞瘤病人占所有胶质瘤病人的一半以上，在北美每年约有8000到10000的新发病例，发病高峰多在45岁至55岁之间。近十年来，虽然对该肿瘤的病理生理特性有了进一步的理解，但是其治疗没有任何进展。经外科手术、甚至联合放疗与化疗，患者愈后仍很差，其中位生存期无明显改善，一般在9-12个月之间，且病人几乎无一例外的会出现肿瘤复发。 最近研究发现，脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞(Brain tumor stem cell，BTSC)，是引发肿瘤并维持脑肿瘤生长的细胞来源(Tumor-initiating cell，TIC)，肿瘤干细胞可耐化疗、耐放射，在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用。BTSC是一群具有自我更新和重建原肿瘤组织表现型的肿瘤细胞，它具有三大特点即：无限增殖、自我更新、多潜能分化。在肿瘤球培养基(tumor sphere medium，TSM)培养条件下，可以形成典型的神经球样结构，并可表达一系列神经干细胞(Neural stem cell，NSC)特异性标记，如CD133、musashi、Nestin、bmi-1、PSP、melk等。在诱导分化条件下，可以分化表达神经元和胶质细胞标记的肿瘤细胞，其表现型与来源肿瘤样本相同。 因此建立体外培养的恶性胶质瘤细胞系及分离培养肿瘤干细胞为进一步研究脑肿瘤的发病机制和细胞生物学特性，为探索新型药物治疗该肿瘤提供了一个较理想的实验模型。 目的： 1．建立GBM细胞系，初步探讨其生物学特性 2．分离、培养及鉴定GBM肿瘤干细胞，初步探讨生物学特性 方法： 1．GBM原代细胞生长的体外培养条件优化 进行GBM原代细胞培养时，分别采用不同的细胞分离、纯化方法和培养条件，优化最适合GBM的培养条件。分离方法优化：分别采用机械分离法、胰酶消化法；纯化方法优化：差异贴壁法、胶原酶消化法；培养条件优化：培养基分别使用DMEM、RPMI1640、DMEM／F12。 2．建系细胞株生物学特性初步研究 (1)体外实验研究：光镜、电镜下观察细胞形态及超微结构、MTT法检测细胞生长曲线及药物敏感性、克隆形成实验了解细胞增殖特性、染色体核型分析探讨细胞遗传学特性。 (2)体内实验研究：裸鼠原位接种检测该细胞株的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性。 3．GBM肿瘤干细胞分离、培养与鉴定 通过条件培养基分离、培养GBM干细胞；细胞计数法、有限稀释实验及流式细胞仪对肿瘤干细胞进行鉴定；原位接种肿瘤干细胞于裸鼠检测该细胞的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性，进行体内鉴定。 4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨 通过RT-PCR比较单层贴壁生长肿瘤细胞与肿瘤干细胞相关基因表达的差异。通过流式细胞仪(flow cytometry，FCM)比较单层贴壁生长细胞与肿瘤干细胞细胞周期、细胞亚群(subpopulation，SP)细胞比例及CD133阳性细胞含量的差异。 结果： 1．原代GBM细胞分离培养条件： 最适合的条件是机械分离法分离细胞后、差异贴壁与消化纯化法相结合纯化细胞、用含10％胎牛血清DMEM／F12培养基进行培养。 2．GBM细胞系生物学特性的初步研究： (1)体外实验结果：光镜下GBM细胞系形态多样，细胞贴壁能力有所差异；电镜下胞核外形不规则，可见假性核内包涵体，核分裂易见；胞浆内细胞器明显增多，可出现发育不良的细胞器，也可见胶质丝；该细胞系群体倍增时间约为60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，亚四倍体占分析核型的35％，余可见单倍体、超三倍体等核型；顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对GBM细胞均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系；DDP、VP-16、TANⅡA作用GBM细胞第三天，IC50分别为7.5mg／L、85mg／L、和0.12mg／L，差异有统计学意义(P＜0.01)。TANⅡA的细胞毒作用最强，其次为DDP，VP-16对细胞的抑制作用最小。 (2)体内实验结果：1×105GBM细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为100％，且裸鼠肿瘤的病理组织形态及组织再培养细胞形态学观察与原有肿瘤组织及细胞相似，裸鼠移植瘤组织中表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(+)与神经巢蛋白(Nestin)(+)。 3．GBM肿瘤干细胞分离培养与鉴定： 通过条件培养可分离培养出GBM肿瘤干细胞；BTSC具有自我更新能力；BTSC细胞生长周期约为150h，GBM中具有自我更新能力的细胞约占1.33％。肿瘤球中40.2％细胞表达CD133，9.1％的细胞为SP细胞。通过裸鼠原位接种结果显示：1000个GBM肿瘤干细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为50％，2万组GBM肿瘤干细胞接种裸鼠成瘤率为80％。移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，表达CD133(+)、GFAP(+)及Nestin(+)蛋白。 4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨 与单层贴壁细胞比较，肿瘤干细胞乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、CD133、Nestin、Wnt基因mRNA表达增强，GFAP、PTEN基因mRNA表达减弱(P＜0.05)。单层贴壁细胞与肿瘤干细胞细胞周期分布、SP细胞比例及CD133表达含量均有差异(P＜0.05)：肿瘤干细胞增殖指数为25.6％，处于G0／G1期细胞数为74.4％、SP细胞含量为9.1％、CD133+细胞含量40.2％；单层贴壁细胞增殖指数为34.6％，处于G0／G1期细胞数为65.4％、SP细胞含量0.1％、CD133+细胞含量1.3％。 结论： 1．成功的建立了GBM原代细胞系，优化了GBM原代培养条件。 2．该细胞系倍增时间60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，可异种移植成瘤，鼠瘤组织表达GFAP、Nestin蛋白，提示建系成功。可为进一步研究GBM的发病机制和细胞分子生物学特性提供较理想的体内外实验模型。 3．顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对该GBM细胞系均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系，为研发新型药物治疗该肿瘤提供了实验依据。 4．GBM肿瘤细胞中存在1.33％具有异常增殖能力的BTSC；可以利用条件培养基成功分离和培养BTSC；BTSC在TSM培养环境中可以增殖，形成连续传代的脑肿瘤干细胞球。 5．BTSC表面标志物的检测：肿瘤球中40.2％的细胞为CD133阳性细胞，约9.1％的细胞为SP细胞。 6．条件培养基培养后的GBM细胞仅1000即可在裸鼠原位成瘤；移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，裸鼠移植瘤组织中表达CD133、GFAP及Nestin蛋白，可以作为研究GBM的动物模型。 7．GBM干细胞与单层贴壁细胞相比生物学特性有所改变。相关基因表达的改变：与单层贴壁生长GBM细胞相比，BCRP-1、CD133、Nestin、Wnt mRNA表达较SSM培养细胞增强，GFAP、PTEN表达减弱；细胞周期分布、蛋白表达的改变：与单层贴壁细胞相比，GBM干细胞增殖指数降低，处于静止期细胞数量增加。SP细胞含量增加了91倍、CD133+细胞含量增加了30.92倍。体内成瘤活性增强。

双斑萤叶甲生物学特性和防治策略的研究

这是一篇关于双斑萤叶甲,生物学特性,次生物质,药剂筛选的论文, 主要内容为双斑萤叶甲是一种在我国分布很广的多食性害虫,每年给我国造成数亿元的经济损失。长期以来以化学农药为主的单一防治措施收效不大,并导致了农药残留、污染环境以及破坏生态系统中生物多样性和生态平衡关系等一系列问题。筛选低毒、低残留杀虫剂或寻找新的无污染、无公害的防治方法,目前备受关注。本文研究了双斑萤叶甲的生物学特性,进行了杀虫剂筛选试验,研究了不同植物以及玉米不同品种与成虫发生之间的关系,并对利用诱集植物进行防治的可行性进行了探讨,旨在为双斑萤叶甲的综合治理提供依据。 1.田间调查表明,双斑萤叶甲在黑龙江省1年发生1代;寄主广泛,在已调查鉴定的6科16种寄主植物中,成虫主要危害禾本科、豆科、菊科、苋科植物的叶片、花穗或种子,幼虫主要危害禾本科和豆科植物的根;6月中旬田边杂草始见成虫,8月中旬进入为害盛期,田间作物收获后又迁入到杂草和蔬菜田中;以卵在玉米地、大豆田和周围杂草根系土壤中越冬,翌年4月中下旬开始孵化。室内研究表明,最适合双斑萤叶甲存活和生殖产卵的温度为20～25℃,湿度为75%～85%RH。 2.田间调查和室内试验表明,在四单19、垦粘1号、丰禾10、庆单3、庆单4、龙青1号6个玉米品种和紫花苜蓿、金盏菊2种植物中,对垦粘1号和紫花苜蓿的选择性强,对龙育1号、金盏菊、庆单3和丰禾10的选择性中等,对庆单4和四单19的选择性弱。紫花苜蓿可以作为诱集植物与玉米搭配种植,来减轻对主栽玉米的危害。 3.在对四单19、垦粘1号、丰禾10、庆单3、庆单4、龙青1号6种玉米品种次生物质研究中发现,乙醇和挥发油提取物对双斑萤叶甲成虫均具有一定的刺激取食和产卵作用:6种乙醇提取物中,垦粘1号对成虫产卵的诱集效果最好,四单19最差;6种挥发油提取物中,垦粘1号对产卵、取食和嗅觉的引诱效果均最好,四单19最差。在对天敌瓢甲嗅觉反应测定中发现,其对庆单3、四单19和龙育1号3种挥发油提取物表现出一定的嗅觉反应。 4.通过室内毒力测定和田间防效试验对1.8%阿维菌素EC、90%敌百虫TC、25%吡虫啉WP、36%啶虫脒WG、50g/L锐劲特SE、1.2%百杀虫EC和0.2%瑞金得ME共7种药剂进行了筛选,50g/L锐劲特SE具有防效好、见效快、持效期长、对天敌杀伤率小等特点,是防治双斑萤叶甲的最佳药剂。90%敌百虫TC对天敌有很大的杀伤作用,0.2%瑞金得ME对天敌的影响低,但对双斑萤叶甲的防治效果不理想,而生物杀虫剂1.8%阿维菌素对天敌有一定的杀伤作用,且不具有速效性。

～（60）Co-γ射线辐射后唐菖蒲不同品种的生物学特性及基因组变异研究

这是一篇关于唐菖蒲,辐射变异,生物学特性,RAPD,随机扩增多态性DNA的论文, 主要内容为为进一步了解和探索辐射在唐菖蒲育种中对唐菖蒲主要农艺和商品性状以及基因组的影响,通过对三个唐菖蒲品种“豪华”、“江山美人”、“新秀”种球分别经过0GY、25GY、50GY、75GY、100GY、150GY剂量60Co—γ射线照射后,植入大田,对各品种和处理进行了形态指标测定以及采用RAPD技术对变异唐菖蒲植株基因进行了研究,在唐菖蒲辐射育种适宜剂量、处理条件、突变频率和突变谱等方面进行了较系统的研究。取得了如下结果: 1.对生物学特性的研究结果表明不同剂量60Co—γ射线辐射对唐菖蒲各形态指标均产生了影响,并且变异程度和辐射剂量成正相关,即随着剂量的增大唐菖蒲各性状的变异程度也随之增大。种球萌发方面,各品种小剂量25-75GY辐射促使种球发芽时间提前,且对发芽率影响不大;但是总体随着剂量增大,发芽率有所降低。低剂量25GY辐射促进了植株株高、花序长等生长指标,辐射剂量在75GY左右,辐射变异率较高,在辐射剂量高于100GY时各指标均产生明显下降趋势。 2.建立了适用于唐菖蒲RAPD分子标记的反应体系,其优化体系为:引物(10μg/L)20ng,dNTPs(2.5mmol/L)2.0μL, MgCl2(25mmol/L) 2.2μL, 10*Reaction Buffer 2.5μL,Taq酶0.3μL,模板DNA (20ng/μL) 20ng,ddH2O15μL。优化其扩增程序:94℃、10min , 1循环; 94℃、30s, 37℃、60s,72℃、90s,40循环;72℃、5min,1循环; 4℃保存。利用该体系对田间变异植株和对照进行了分析、研究。从12种引物中筛选出了9种引物其扩增产物表现出明显的多态性差异。 3.RAPD结果表明,经过不同辐射剂量处理获得的变异唐菖蒲在DNA水平上存在多态性差异。分析了变异株间遗传物质的差异,并讨论了RAPD的可靠性。各品种:“豪华”基因相似系数在50%-92.3%之间,单匹配系数在0.333-0.464之间;“江山美人”基因相似系数在60%-93.3%之间,单匹配系数在0.357-0.469之间;“新秀”基因相似系数在44.5%-94.1%之间,单匹配系数在0.344-0.472之间。各品种对辐射的敏感度不同,品种新秀对辐射较为敏感。

花绒坚甲的人工饲养技术研究

这是一篇关于花绒坚甲,生物学特性,人工饲料的论文, 主要内容为花绒坚甲即花绒穴甲，学名为Dastarcus helophoroides Fairmaire，以其幼虫体外寄生天牛老熟幼虫、蛹。自然界中花绒坚甲种群呈点状分布，扩散能力弱，只有通过大量的人工繁殖和释放，人为扩散花绒坚甲的分布和增加种群数量，才能增强对天牛的整体控制能力。本文在以上研究的基础上，对花绒坚甲的生物学特性、人工饲料和人工饲养技术进行了研究，得出结果如下： 1．生活史：3年内可连续发生6代及21对姊妹代，世代重叠。成虫10月上旬后在人工虫道内越冬，翌年3月上旬开始活动，越冬成虫1年产卵2次，卵期平均为12.7d，幼虫期平均为8.4d，蛹期平均为25.6d。第1次和第2次产卵发育的世代为第1姊妹代和第2姊妹代。第1姊妹代成虫6月中旬开始羽化，8月下旬羽化结束；第2姊妹代成虫8月下旬开始羽化，9月下旬羽化结束，当年不产卵。第1姊妹代的部分成虫于当年8月上旬开始产卵，9月下旬第2代成虫羽化。 2．生活习性：成虫的食性较杂，善爬行，具有很强的假死性，寿命长达4年以上，卵可以在5℃的冰箱内保存40天以上，不影响其正常发育和孵化；初孵幼虫的爬行能力强，每小时爬行的直线距离为5～7cm，不取食可存活3～4天，发育过程中的幼虫形态呈拟蛆型，幼虫群居寄生取食，仅有极少数表现自相残杀的习性；茧初为白色，1～2天后变为黄色，随着时间的推移渐变为黄褐色。 3．有效积温和发育起点温度：卵的发育起点温度13.2±0.04℃，有效积温121.7±9.58日度；幼虫的发育起点温度11.7±0.58℃，有效积温139.0±8.29日度；蛹的发育起点温度13.9±0.99℃，有效积温265.24±9.00日度。 4．人工饲料的研究：饲料5和饲料C分别是室内人工饲养花绒坚甲成虫和幼虫的最佳饲料。花绒坚甲初孵幼虫可以在黄粉虫蛹上寄生，结茧化蛹，但成虫不能羽化。 5．室内释放花绒坚甲卵的寄生试验：卵放在木段内，卵期均在18天以上，孵化率平均60％～72％，初孵幼虫对光肩星天牛幼虫的平均寄生率达60％以上；卵放在木段外，卵期缩短为13～15天，平均孵化率及初孵幼虫对光肩星天牛幼虫的平均寄生率均有所提高，分别为83.3％和87.5％。

花绒坚甲的人工饲养技术研究

这是一篇关于花绒坚甲,生物学特性,人工饲料的论文, 主要内容为花绒坚甲即花绒穴甲，学名为Dastarcus helophoroides Fairmaire，以其幼虫体外寄生天牛老熟幼虫、蛹。自然界中花绒坚甲种群呈点状分布，扩散能力弱，只有通过大量的人工繁殖和释放，人为扩散花绒坚甲的分布和增加种群数量，才能增强对天牛的整体控制能力。本文在以上研究的基础上，对花绒坚甲的生物学特性、人工饲料和人工饲养技术进行了研究，得出结果如下： 1．生活史：3年内可连续发生6代及21对姊妹代，世代重叠。成虫10月上旬后在人工虫道内越冬，翌年3月上旬开始活动，越冬成虫1年产卵2次，卵期平均为12.7d，幼虫期平均为8.4d，蛹期平均为25.6d。第1次和第2次产卵发育的世代为第1姊妹代和第2姊妹代。第1姊妹代成虫6月中旬开始羽化，8月下旬羽化结束；第2姊妹代成虫8月下旬开始羽化，9月下旬羽化结束，当年不产卵。第1姊妹代的部分成虫于当年8月上旬开始产卵，9月下旬第2代成虫羽化。 2．生活习性：成虫的食性较杂，善爬行，具有很强的假死性，寿命长达4年以上，卵可以在5℃的冰箱内保存40天以上，不影响其正常发育和孵化；初孵幼虫的爬行能力强，每小时爬行的直线距离为5～7cm，不取食可存活3～4天，发育过程中的幼虫形态呈拟蛆型，幼虫群居寄生取食，仅有极少数表现自相残杀的习性；茧初为白色，1～2天后变为黄色，随着时间的推移渐变为黄褐色。 3．有效积温和发育起点温度：卵的发育起点温度13.2±0.04℃，有效积温121.7±9.58日度；幼虫的发育起点温度11.7±0.58℃，有效积温139.0±8.29日度；蛹的发育起点温度13.9±0.99℃，有效积温265.24±9.00日度。 4．人工饲料的研究：饲料5和饲料C分别是室内人工饲养花绒坚甲成虫和幼虫的最佳饲料。花绒坚甲初孵幼虫可以在黄粉虫蛹上寄生，结茧化蛹，但成虫不能羽化。 5．室内释放花绒坚甲卵的寄生试验：卵放在木段内，卵期均在18天以上，孵化率平均60％～72％，初孵幼虫对光肩星天牛幼虫的平均寄生率达60％以上；卵放在木段外，卵期缩短为13～15天，平均孵化率及初孵幼虫对光肩星天牛幼虫的平均寄生率均有所提高，分别为83.3％和87.5％。

大猿叶虫不同地理种群的生态适应性和山东种群生物学特性的研究

这是一篇关于大猿叶虫,生物学特性,地理种群,生态适应性,滞育,过冷却点的论文, 主要内容为大猿叶虫Colaphellus bowringi Baly属鞘翅目Coleptera,叶甲科Chrysomelidae,无缘叶甲属Colaphellus,是我国十字花科蔬菜上的一种重要食叶害虫。本文以其为试验材料,阐述了大猿叶虫山东种群的生物学特性,系统地对不同地理种群大猿叶虫的生态适应性进行了研究,包括不同的光周期和温度对大猿叶虫不同地理种群滞育诱导的作用、不同地理种群大猿叶虫抗寒能力和低温生存能力,以及光照和温度对滞育后种群抗寒性的影响。主要结果如下: 1光周期和温度的滞育诱导 对于江西种群,当光周期的暗期长度为12～24h时,有效地防止滞育的发生;而当暗期长度短于12h则诱导不同程度的滞育,4～8h的暗期长度明显诱导了较高的滞育率。黑龙江种群和山东种群不存在光周期反应。温度本身能够诱导滞育的发生。当温度低于20℃时,所有的个体均进入滞育;随着温度的逐渐上升,三种群的滞育比例逐步降低。28℃时,江西和山东种群的滞育率分别为22%和92%,而黑龙江种群的所有个体仍处于滞育状态;当温度达30℃,江西和山东种群滞育率分别降至5%和78%时,黑龙江种群滞育率降为94%,出现非滞育个体。 2大猿叶虫耐寒性研究 随着纬度的升高,大猿叶虫耐寒性逐渐增强。黑龙江、山东和江西三种群过冷却点均于一月份达到最低值,分别为-23.7℃、-22.3℃和-20.7℃,种群间差异显著。 试验结果表明滞育与非滞育成虫的低温生存能力存在一定的差异:-20℃时,三种群滞育成虫的半致死时间分别为0.99h、0.75h和0.64h,而非滞育成虫的半致死时间相对较短,分别为0.50h、0.34h和0.29h,滞育成虫的耐寒能力明显强于非滞育成虫,北方种群耐受低温的能力明显强于南方种群。其它低温下的情况也显示了同样的结果。 各种群的过冷却点都低于当地各月平均温度,越冬成虫可以保持较高的越冬存活率。 4℃低温驯化10d后,大猿叶虫黑龙江种群成虫的耐寒能力无变化,山东种群和江西种群有不同程度的提高。三种群驯化前后过冷却点无差异。 3光照和温度对滞育后大猿叶虫耐寒性影响 高温和短日照可降低大猿叶虫的过冷却能力。温度能更大程度的降低其过冷却能力,长日照可阻碍其降低但无法逆转。随着纬度位置的升高,光周期的影响逐渐消失,温度起到决定性作用。对黑龙江种群进行不同光周期处理40d,过冷却点差异不显著。 4大猿叶虫山东种群生物学特性 大猿叶虫属鞘翅目叶甲科无缘叶甲属,分卵、幼虫、蛹、成虫四个虫态。在山东该虫有两个明显的危害期,分别出现在春季和秋季,以成虫在土中越夏和越冬,年发生1～2代,部分隔年繁殖。雌雄一生能多次交配,25℃下产卵期为11～34d,每雌产卵量平均861粒。蛹期一般为3～5d,主要是集中于凌晨0:00～8:00进行化蛹,占化蛹总量的66.3%。羽化主要在白天进行。 5温度对大猿叶虫生长发育和繁殖的影响 在15～28℃温区内,大猿叶虫各虫态发育历期随着温度的升高而缩短。卵的历期由15℃下的13.95d降至28℃下的5.03d,幼虫的历期由23.45d降至8.45d,蛹的历期由12.37d降至4.33d。 温度对成虫前各虫态的存活率影响显著,15℃～28℃范围内存活率较高,其中在20℃～25℃范围内,均达到90%以上。30℃下各虫态存活率均较低,卵的孵化率仅为48.17%。 滞育后雌虫寿命随着温度的降低显著延长,同时产卵期和产卵量也呈下降趋势。

花绒坚甲的人工饲养技术研究

这是一篇关于花绒坚甲,生物学特性,人工饲料的论文, 主要内容为花绒坚甲即花绒穴甲，学名为Dastarcus helophoroides Fairmaire，以其幼虫体外寄生天牛老熟幼虫、蛹。自然界中花绒坚甲种群呈点状分布，扩散能力弱，只有通过大量的人工繁殖和释放，人为扩散花绒坚甲的分布和增加种群数量，才能增强对天牛的整体控制能力。本文在以上研究的基础上，对花绒坚甲的生物学特性、人工饲料和人工饲养技术进行了研究，得出结果如下： 1．生活史：3年内可连续发生6代及21对姊妹代，世代重叠。成虫10月上旬后在人工虫道内越冬，翌年3月上旬开始活动，越冬成虫1年产卵2次，卵期平均为12.7d，幼虫期平均为8.4d，蛹期平均为25.6d。第1次和第2次产卵发育的世代为第1姊妹代和第2姊妹代。第1姊妹代成虫6月中旬开始羽化，8月下旬羽化结束；第2姊妹代成虫8月下旬开始羽化，9月下旬羽化结束，当年不产卵。第1姊妹代的部分成虫于当年8月上旬开始产卵，9月下旬第2代成虫羽化。 2．生活习性：成虫的食性较杂，善爬行，具有很强的假死性，寿命长达4年以上，卵可以在5℃的冰箱内保存40天以上，不影响其正常发育和孵化；初孵幼虫的爬行能力强，每小时爬行的直线距离为5～7cm，不取食可存活3～4天，发育过程中的幼虫形态呈拟蛆型，幼虫群居寄生取食，仅有极少数表现自相残杀的习性；茧初为白色，1～2天后变为黄色，随着时间的推移渐变为黄褐色。 3．有效积温和发育起点温度：卵的发育起点温度13.2±0.04℃，有效积温121.7±9.58日度；幼虫的发育起点温度11.7±0.58℃，有效积温139.0±8.29日度；蛹的发育起点温度13.9±0.99℃，有效积温265.24±9.00日度。 4．人工饲料的研究：饲料5和饲料C分别是室内人工饲养花绒坚甲成虫和幼虫的最佳饲料。花绒坚甲初孵幼虫可以在黄粉虫蛹上寄生，结茧化蛹，但成虫不能羽化。 5．室内释放花绒坚甲卵的寄生试验：卵放在木段内，卵期均在18天以上，孵化率平均60％～72％，初孵幼虫对光肩星天牛幼虫的平均寄生率达60％以上；卵放在木段外，卵期缩短为13～15天，平均孵化率及初孵幼虫对光肩星天牛幼虫的平均寄生率均有所提高，分别为83.3％和87.5％。

恶性胶质瘤细胞系的建立及其肿瘤干细胞生物学特性的初步研究

这是一篇关于恶性胶质瘤,细胞系,肿瘤干细胞,生物学特性,细胞培养,动物模型的论文, 主要内容为脑肿瘤是成人危害性极大的恶性肿瘤之一，儿童因肿瘤而死亡的主要肿瘤类型，发病率和死亡率不断升高，严重的威胁着人类的健康和生命。在过去25年里，原发恶性脑肿瘤病人一直在增加，尤其在中年人以每年1.2％的速率在增加。2006年，在美国约有18120个新发脑肿瘤病人，其中约12820个死亡。多形性胶质母细胞瘤(gliobastona multiforme，GBM)，颅内肿瘤分类属星形细胞瘤Ⅲ-Ⅳ级，是最常见的颅内原发肿瘤之一，约占成人因肿瘤而死亡总人数的2.3％。多形性胶质母细胞瘤病人占所有胶质瘤病人的一半以上，在北美每年约有8000到10000的新发病例，发病高峰多在45岁至55岁之间。近十年来，虽然对该肿瘤的病理生理特性有了进一步的理解，但是其治疗没有任何进展。经外科手术、甚至联合放疗与化疗，患者愈后仍很差，其中位生存期无明显改善，一般在9-12个月之间，且病人几乎无一例外的会出现肿瘤复发。 最近研究发现，脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞(Brain tumor stem cell，BTSC)，是引发肿瘤并维持脑肿瘤生长的细胞来源(Tumor-initiating cell，TIC)，肿瘤干细胞可耐化疗、耐放射，在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用。BTSC是一群具有自我更新和重建原肿瘤组织表现型的肿瘤细胞，它具有三大特点即：无限增殖、自我更新、多潜能分化。在肿瘤球培养基(tumor sphere medium，TSM)培养条件下，可以形成典型的神经球样结构，并可表达一系列神经干细胞(Neural stem cell，NSC)特异性标记，如CD133、musashi、Nestin、bmi-1、PSP、melk等。在诱导分化条件下，可以分化表达神经元和胶质细胞标记的肿瘤细胞，其表现型与来源肿瘤样本相同。 因此建立体外培养的恶性胶质瘤细胞系及分离培养肿瘤干细胞为进一步研究脑肿瘤的发病机制和细胞生物学特性，为探索新型药物治疗该肿瘤提供了一个较理想的实验模型。 目的： 1．建立GBM细胞系，初步探讨其生物学特性 2．分离、培养及鉴定GBM肿瘤干细胞，初步探讨生物学特性 方法： 1．GBM原代细胞生长的体外培养条件优化 进行GBM原代细胞培养时，分别采用不同的细胞分离、纯化方法和培养条件，优化最适合GBM的培养条件。分离方法优化：分别采用机械分离法、胰酶消化法；纯化方法优化：差异贴壁法、胶原酶消化法；培养条件优化：培养基分别使用DMEM、RPMI1640、DMEM／F12。 2．建系细胞株生物学特性初步研究 (1)体外实验研究：光镜、电镜下观察细胞形态及超微结构、MTT法检测细胞生长曲线及药物敏感性、克隆形成实验了解细胞增殖特性、染色体核型分析探讨细胞遗传学特性。 (2)体内实验研究：裸鼠原位接种检测该细胞株的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性。 3．GBM肿瘤干细胞分离、培养与鉴定 通过条件培养基分离、培养GBM干细胞；细胞计数法、有限稀释实验及流式细胞仪对肿瘤干细胞进行鉴定；原位接种肿瘤干细胞于裸鼠检测该细胞的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性，进行体内鉴定。 4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨 通过RT-PCR比较单层贴壁生长肿瘤细胞与肿瘤干细胞相关基因表达的差异。通过流式细胞仪(flow cytometry，FCM)比较单层贴壁生长细胞与肿瘤干细胞细胞周期、细胞亚群(subpopulation，SP)细胞比例及CD133阳性细胞含量的差异。 结果： 1．原代GBM细胞分离培养条件： 最适合的条件是机械分离法分离细胞后、差异贴壁与消化纯化法相结合纯化细胞、用含10％胎牛血清DMEM／F12培养基进行培养。 2．GBM细胞系生物学特性的初步研究： (1)体外实验结果：光镜下GBM细胞系形态多样，细胞贴壁能力有所差异；电镜下胞核外形不规则，可见假性核内包涵体，核分裂易见；胞浆内细胞器明显增多，可出现发育不良的细胞器，也可见胶质丝；该细胞系群体倍增时间约为60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，亚四倍体占分析核型的35％，余可见单倍体、超三倍体等核型；顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对GBM细胞均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系；DDP、VP-16、TANⅡA作用GBM细胞第三天，IC50分别为7.5mg／L、85mg／L、和0.12mg／L，差异有统计学意义(P＜0.01)。TANⅡA的细胞毒作用最强，其次为DDP，VP-16对细胞的抑制作用最小。 (2)体内实验结果：1×105GBM细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为100％，且裸鼠肿瘤的病理组织形态及组织再培养细胞形态学观察与原有肿瘤组织及细胞相似，裸鼠移植瘤组织中表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(+)与神经巢蛋白(Nestin)(+)。 3．GBM肿瘤干细胞分离培养与鉴定： 通过条件培养可分离培养出GBM肿瘤干细胞；BTSC具有自我更新能力；BTSC细胞生长周期约为150h，GBM中具有自我更新能力的细胞约占1.33％。肿瘤球中40.2％细胞表达CD133，9.1％的细胞为SP细胞。通过裸鼠原位接种结果显示：1000个GBM肿瘤干细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为50％，2万组GBM肿瘤干细胞接种裸鼠成瘤率为80％。移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，表达CD133(+)、GFAP(+)及Nestin(+)蛋白。 4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨 与单层贴壁细胞比较，肿瘤干细胞乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、CD133、Nestin、Wnt基因mRNA表达增强，GFAP、PTEN基因mRNA表达减弱(P＜0.05)。单层贴壁细胞与肿瘤干细胞细胞周期分布、SP细胞比例及CD133表达含量均有差异(P＜0.05)：肿瘤干细胞增殖指数为25.6％，处于G0／G1期细胞数为74.4％、SP细胞含量为9.1％、CD133+细胞含量40.2％；单层贴壁细胞增殖指数为34.6％，处于G0／G1期细胞数为65.4％、SP细胞含量0.1％、CD133+细胞含量1.3％。 结论： 1．成功的建立了GBM原代细胞系，优化了GBM原代培养条件。 2．该细胞系倍增时间60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，可异种移植成瘤，鼠瘤组织表达GFAP、Nestin蛋白，提示建系成功。可为进一步研究GBM的发病机制和细胞分子生物学特性提供较理想的体内外实验模型。 3．顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对该GBM细胞系均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系，为研发新型药物治疗该肿瘤提供了实验依据。 4．GBM肿瘤细胞中存在1.33％具有异常增殖能力的BTSC；可以利用条件培养基成功分离和培养BTSC；BTSC在TSM培养环境中可以增殖，形成连续传代的脑肿瘤干细胞球。 5．BTSC表面标志物的检测：肿瘤球中40.2％的细胞为CD133阳性细胞，约9.1％的细胞为SP细胞。 6．条件培养基培养后的GBM细胞仅1000即可在裸鼠原位成瘤；移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，裸鼠移植瘤组织中表达CD133、GFAP及Nestin蛋白，可以作为研究GBM的动物模型。 7．GBM干细胞与单层贴壁细胞相比生物学特性有所改变。相关基因表达的改变：与单层贴壁生长GBM细胞相比，BCRP-1、CD133、Nestin、Wnt mRNA表达较SSM培养细胞增强，GFAP、PTEN表达减弱；细胞周期分布、蛋白表达的改变：与单层贴壁细胞相比，GBM干细胞增殖指数降低，处于静止期细胞数量增加。SP细胞含量增加了91倍、CD133+细胞含量增加了30.92倍。体内成瘤活性增强。

花绒坚甲的人工饲养技术研究

这是一篇关于花绒坚甲,生物学特性,人工饲料的论文, 主要内容为花绒坚甲即花绒穴甲，学名为Dastarcus helophoroides Fairmaire，以其幼虫体外寄生天牛老熟幼虫、蛹。自然界中花绒坚甲种群呈点状分布，扩散能力弱，只有通过大量的人工繁殖和释放，人为扩散花绒坚甲的分布和增加种群数量，才能增强对天牛的整体控制能力。本文在以上研究的基础上，对花绒坚甲的生物学特性、人工饲料和人工饲养技术进行了研究，得出结果如下： 1．生活史：3年内可连续发生6代及21对姊妹代，世代重叠。成虫10月上旬后在人工虫道内越冬，翌年3月上旬开始活动，越冬成虫1年产卵2次，卵期平均为12.7d，幼虫期平均为8.4d，蛹期平均为25.6d。第1次和第2次产卵发育的世代为第1姊妹代和第2姊妹代。第1姊妹代成虫6月中旬开始羽化，8月下旬羽化结束；第2姊妹代成虫8月下旬开始羽化，9月下旬羽化结束，当年不产卵。第1姊妹代的部分成虫于当年8月上旬开始产卵，9月下旬第2代成虫羽化。 2．生活习性：成虫的食性较杂，善爬行，具有很强的假死性，寿命长达4年以上，卵可以在5℃的冰箱内保存40天以上，不影响其正常发育和孵化；初孵幼虫的爬行能力强，每小时爬行的直线距离为5～7cm，不取食可存活3～4天，发育过程中的幼虫形态呈拟蛆型，幼虫群居寄生取食，仅有极少数表现自相残杀的习性；茧初为白色，1～2天后变为黄色，随着时间的推移渐变为黄褐色。 3．有效积温和发育起点温度：卵的发育起点温度13.2±0.04℃，有效积温121.7±9.58日度；幼虫的发育起点温度11.7±0.58℃，有效积温139.0±8.29日度；蛹的发育起点温度13.9±0.99℃，有效积温265.24±9.00日度。 4．人工饲料的研究：饲料5和饲料C分别是室内人工饲养花绒坚甲成虫和幼虫的最佳饲料。花绒坚甲初孵幼虫可以在黄粉虫蛹上寄生，结茧化蛹，但成虫不能羽化。 5．室内释放花绒坚甲卵的寄生试验：卵放在木段内，卵期均在18天以上，孵化率平均60％～72％，初孵幼虫对光肩星天牛幼虫的平均寄生率达60％以上；卵放在木段外，卵期缩短为13～15天，平均孵化率及初孵幼虫对光肩星天牛幼虫的平均寄生率均有所提高，分别为83.3％和87.5％。

恶性胶质瘤细胞系的建立及其肿瘤干细胞生物学特性的初步研究

这是一篇关于恶性胶质瘤,细胞系,肿瘤干细胞,生物学特性,细胞培养,动物模型的论文, 主要内容为脑肿瘤是成人危害性极大的恶性肿瘤之一，儿童因肿瘤而死亡的主要肿瘤类型，发病率和死亡率不断升高，严重的威胁着人类的健康和生命。在过去25年里，原发恶性脑肿瘤病人一直在增加，尤其在中年人以每年1.2％的速率在增加。2006年，在美国约有18120个新发脑肿瘤病人，其中约12820个死亡。多形性胶质母细胞瘤(gliobastona multiforme，GBM)，颅内肿瘤分类属星形细胞瘤Ⅲ-Ⅳ级，是最常见的颅内原发肿瘤之一，约占成人因肿瘤而死亡总人数的2.3％。多形性胶质母细胞瘤病人占所有胶质瘤病人的一半以上，在北美每年约有8000到10000的新发病例，发病高峰多在45岁至55岁之间。近十年来，虽然对该肿瘤的病理生理特性有了进一步的理解，但是其治疗没有任何进展。经外科手术、甚至联合放疗与化疗，患者愈后仍很差，其中位生存期无明显改善，一般在9-12个月之间，且病人几乎无一例外的会出现肿瘤复发。 最近研究发现，脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞(Brain tumor stem cell，BTSC)，是引发肿瘤并维持脑肿瘤生长的细胞来源(Tumor-initiating cell，TIC)，肿瘤干细胞可耐化疗、耐放射，在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用。BTSC是一群具有自我更新和重建原肿瘤组织表现型的肿瘤细胞，它具有三大特点即：无限增殖、自我更新、多潜能分化。在肿瘤球培养基(tumor sphere medium，TSM)培养条件下，可以形成典型的神经球样结构，并可表达一系列神经干细胞(Neural stem cell，NSC)特异性标记，如CD133、musashi、Nestin、bmi-1、PSP、melk等。在诱导分化条件下，可以分化表达神经元和胶质细胞标记的肿瘤细胞，其表现型与来源肿瘤样本相同。 因此建立体外培养的恶性胶质瘤细胞系及分离培养肿瘤干细胞为进一步研究脑肿瘤的发病机制和细胞生物学特性，为探索新型药物治疗该肿瘤提供了一个较理想的实验模型。 目的： 1．建立GBM细胞系，初步探讨其生物学特性 2．分离、培养及鉴定GBM肿瘤干细胞，初步探讨生物学特性 方法： 1．GBM原代细胞生长的体外培养条件优化 进行GBM原代细胞培养时，分别采用不同的细胞分离、纯化方法和培养条件，优化最适合GBM的培养条件。分离方法优化：分别采用机械分离法、胰酶消化法；纯化方法优化：差异贴壁法、胶原酶消化法；培养条件优化：培养基分别使用DMEM、RPMI1640、DMEM／F12。 2．建系细胞株生物学特性初步研究 (1)体外实验研究：光镜、电镜下观察细胞形态及超微结构、MTT法检测细胞生长曲线及药物敏感性、克隆形成实验了解细胞增殖特性、染色体核型分析探讨细胞遗传学特性。 (2)体内实验研究：裸鼠原位接种检测该细胞株的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性。 3．GBM肿瘤干细胞分离、培养与鉴定 通过条件培养基分离、培养GBM干细胞；细胞计数法、有限稀释实验及流式细胞仪对肿瘤干细胞进行鉴定；原位接种肿瘤干细胞于裸鼠检测该细胞的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性，进行体内鉴定。 4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨 通过RT-PCR比较单层贴壁生长肿瘤细胞与肿瘤干细胞相关基因表达的差异。通过流式细胞仪(flow cytometry，FCM)比较单层贴壁生长细胞与肿瘤干细胞细胞周期、细胞亚群(subpopulation，SP)细胞比例及CD133阳性细胞含量的差异。 结果： 1．原代GBM细胞分离培养条件： 最适合的条件是机械分离法分离细胞后、差异贴壁与消化纯化法相结合纯化细胞、用含10％胎牛血清DMEM／F12培养基进行培养。 2．GBM细胞系生物学特性的初步研究： (1)体外实验结果：光镜下GBM细胞系形态多样，细胞贴壁能力有所差异；电镜下胞核外形不规则，可见假性核内包涵体，核分裂易见；胞浆内细胞器明显增多，可出现发育不良的细胞器，也可见胶质丝；该细胞系群体倍增时间约为60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，亚四倍体占分析核型的35％，余可见单倍体、超三倍体等核型；顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对GBM细胞均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系；DDP、VP-16、TANⅡA作用GBM细胞第三天，IC50分别为7.5mg／L、85mg／L、和0.12mg／L，差异有统计学意义(P＜0.01)。TANⅡA的细胞毒作用最强，其次为DDP，VP-16对细胞的抑制作用最小。 (2)体内实验结果：1×105GBM细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为100％，且裸鼠肿瘤的病理组织形态及组织再培养细胞形态学观察与原有肿瘤组织及细胞相似，裸鼠移植瘤组织中表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(+)与神经巢蛋白(Nestin)(+)。 3．GBM肿瘤干细胞分离培养与鉴定： 通过条件培养可分离培养出GBM肿瘤干细胞；BTSC具有自我更新能力；BTSC细胞生长周期约为150h，GBM中具有自我更新能力的细胞约占1.33％。肿瘤球中40.2％细胞表达CD133，9.1％的细胞为SP细胞。通过裸鼠原位接种结果显示：1000个GBM肿瘤干细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为50％，2万组GBM肿瘤干细胞接种裸鼠成瘤率为80％。移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，表达CD133(+)、GFAP(+)及Nestin(+)蛋白。 4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨 与单层贴壁细胞比较，肿瘤干细胞乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、CD133、Nestin、Wnt基因mRNA表达增强，GFAP、PTEN基因mRNA表达减弱(P＜0.05)。单层贴壁细胞与肿瘤干细胞细胞周期分布、SP细胞比例及CD133表达含量均有差异(P＜0.05)：肿瘤干细胞增殖指数为25.6％，处于G0／G1期细胞数为74.4％、SP细胞含量为9.1％、CD133+细胞含量40.2％；单层贴壁细胞增殖指数为34.6％，处于G0／G1期细胞数为65.4％、SP细胞含量0.1％、CD133+细胞含量1.3％。 结论： 1．成功的建立了GBM原代细胞系，优化了GBM原代培养条件。 2．该细胞系倍增时间60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，可异种移植成瘤，鼠瘤组织表达GFAP、Nestin蛋白，提示建系成功。可为进一步研究GBM的发病机制和细胞分子生物学特性提供较理想的体内外实验模型。 3．顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对该GBM细胞系均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系，为研发新型药物治疗该肿瘤提供了实验依据。 4．GBM肿瘤细胞中存在1.33％具有异常增殖能力的BTSC；可以利用条件培养基成功分离和培养BTSC；BTSC在TSM培养环境中可以增殖，形成连续传代的脑肿瘤干细胞球。 5．BTSC表面标志物的检测：肿瘤球中40.2％的细胞为CD133阳性细胞，约9.1％的细胞为SP细胞。 6．条件培养基培养后的GBM细胞仅1000即可在裸鼠原位成瘤；移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，裸鼠移植瘤组织中表达CD133、GFAP及Nestin蛋白，可以作为研究GBM的动物模型。 7．GBM干细胞与单层贴壁细胞相比生物学特性有所改变。相关基因表达的改变：与单层贴壁生长GBM细胞相比，BCRP-1、CD133、Nestin、Wnt mRNA表达较SSM培养细胞增强，GFAP、PTEN表达减弱；细胞周期分布、蛋白表达的改变：与单层贴壁细胞相比，GBM干细胞增殖指数降低，处于静止期细胞数量增加。SP细胞含量增加了91倍、CD133+细胞含量增加了30.92倍。体内成瘤活性增强。