抗条锈病小麦—十倍体长穗偃麦草衍生系CH18067与CH20015的分子细胞遗传学鉴定

这是一篇关于小麦,十倍体长穗偃麦草,抗条锈病,原位杂交,分子标记的论文, 主要内容为十倍体长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum(Popd.)Barkworth and Dewey,2n=10x=70)是偃麦草属(Elytrigia)的一种多年生小麦野生近缘种植物,具有抗寒耐旱、耐盐碱、耐涝的生物特性,并且高抗小麦主要病害,是小麦遗传改良的理想基因源。通过远缘杂交将十倍体长穗偃麦草的优良基因转移到小麦,是拓宽小麦遗传基础的重要方式,本研究在小麦-十倍体长穗偃麦草杂交后代中筛选到两份抗条锈病的衍生系CH18067和CH20015,利用分子细胞遗传学研究方法对其进行了综合鉴定,主要研究结果如下:(1)根尖体细胞观察结果显示CH18067的染色体数目为42;花粉母细胞观察结果显示CH18067减数分裂中期Ⅰ的染色体构型为2n=21Ⅱ,在减数分裂后期Ⅰ染色体均等分离,具有遗传稳定性。FISH和GISH鉴定出CH18067的2D和4D染色体缺失,同时含有2对十倍体长穗偃麦草染色体;Mc-GISH鉴定表明这2对染色体分别归属于J基因组和JS基因组。在分子标记分析中,位于第二部分同源群和第四部分同源群的6个多态性标记在CH18067中扩增出了十倍体长穗偃麦草特异性条带。CH495-2是CH18067和普通小麦阿勃的杂交后代,通过原位杂交和分子标记分析鉴定出CH495-2含有一对2J染色体,得以明确CH18067中J基因组染色体归属于第二同源群,而JS基因组归属于第四同源群。在小麦-二倍体长穗偃麦草液相芯片(Geno Baits?Wheatplus EE)检测中,CH18067在2D和4D染色体上的信号缺失,同时在2E和4E染色体上信号显著富集。综合鉴定结果,确定CH18067为小麦-十倍体长穗偃麦草2J(2D)+4JS(4D)的双重异代换系,并获得了Oligo-p Ta535探针下2J和4JS染色体的FISH核型。CH18067在成株期对条锈病表现为免疫,且具有矮杆、长粒的相关性状,有进一步利用的潜力。(2)细胞学观察结果显示CH20015的体细胞染色体数目为44条,花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ包含22对二价体,在减数分裂后期Ⅰ染色体能够均等分离,具有遗传稳定性。原位杂交鉴定确认CH20015含有40条普通小麦染色体,一对2A染色体缺失,同时拥有2对来自十倍体长穗偃麦草的J基因组染色体。分子标记分析结果显示,位于第二部分同源群和第六部分同源群的9个多态性标记在CH20015中扩增出了十倍体长穗偃麦草特异性条带。在小麦-二倍体长穗偃麦草液相芯片(Geno Baits?Wheatplus EE)检测中,CH20015在2A染色体上信号缺失,同时在2E和6E染色体上信号显著富集。综合鉴定结果,确认CH20015中2J染色体代换了2A染色体,同时附加了一对6J染色体,其为小麦-十倍体长穗偃麦草2J(2A)+6J异附加代换系。通过对比CH18067中2J染色体的FISH核型,进一步确定了6J染色体在Oligo-p Ta535探针下形成的杂交信号。在抗病性鉴定中,CH20015对条锈病表现为高抗,可以进一步创制易位系或渐渗系加以利用。经综合鉴定明确了CH18067和CH20015的遗传组成,为小麦抗病育种和遗传研究提供了候选种质材料。

小麦抗叶锈病基因Lr29作图群体的创制及分子标记开发

这是一篇关于小麦叶锈病,Lr29基因,EMS诱变,基因克隆,分子标记的论文, 主要内容为小麦是世界上重要的粮食作物之一,但小麦叶锈病严重威胁小麦的产量安全。小麦叶锈病(wheat leaf rust)是由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦重要病害之一。防治叶锈病主要依靠化学防治或栽培抗病品种,而培育抗病品种是防治叶锈病最为安全、有效的方法。然而由于不断变异产生新的叶锈小种,导致很多抗叶锈病基因逐渐丧失了抗病性。小麦抗叶锈病基因Lr29是一个全生育期抗病基因(ASR),来源于长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum),对我国叶锈小种具有高水平抗性,而且在生产上尚未被利用,具有重要的应用潜力。由于Lr29基因位于长穗偃麦草易位染色体7E,与普通小麦7D染色体不能正常配对,难以开展连锁分析。为了创建分离群体,并最终克隆该基因,本研究采用EMS(甲基磺酸乙酯)试剂诱变F1杂交种,获得感病突变体并与抗病亲本Lr29NIL回交创建作图群体,并开发了5个7E染色体特异分子标记。本研究为克隆Lr29基因奠定了基础,也为该基因抗病育种提供便于检测的分子标记。本研究的主要结果有:(1)抗叶锈病基因Lr29的初定位。利用Lr29NIL和Delibab的杂交后代群体,在F4代选取了5棵抗病植株和9棵感病植株组成极端性状混池,开展了小麦660k SNP芯片分析。统计纯合多态性SNPs在染色体上的分布,结果显示大部分定位在7D染色体,7D染色体末端4.8-5.8Mb范围内SNP密度最高。(2)Lr29是显性抗叶锈病基因。抗叶锈病的Lr29NIL材料和感叶锈病的CB037、Fielder杂交,选择了12粒F1种子,在苗期接叶锈菌,发现杂交种叶片上没有反应,为免疫类型(等级“0”),而对照CB037则有大量的孢子堆出现,为高感类型(等级“4”)。表明Lr29是一个显性抗叶锈病的基因。(3)EMS诱变处理。为了能快速获得较多的感病突变体,我们选择用EMS诱变Lr29NIL和CB037、Fielder的杂交种共约6600粒。预实验设计了0、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%共5个EMS浓度梯度,每个梯度用100粒杂交种,预实验确定杂交种的半致死浓度为0.4%。为了保证诱变效率,我们选了用0.45%的EMS诱变剩余的6100粒杂交种。(4)M1感病突变体的表型和基因型鉴定。EMS诱变后共获得突变体约2000棵,在苗期接叶锈菌表型鉴定,共筛选得到104棵高感叶锈病的突变体,其中94棵收获得到种子。我们根据一个纯合多态性SNP(AX-95235261)位点,开发了能区分Lr29NIL和CB037、Fielder的分子标记,并命名为LGM1。用该标记鉴定94棵感病突变体,基因型显示其中86棵突变体为杂交种。(5)M2突变体的表型和基因型鉴定。从94份感病M1代突变体中,每份选择10粒种子构成M2群体共690棵。在苗期接叶锈菌表型鉴定,其中89份M1突变体后代全部高感;3份M1突变体后代表型分离16棵抗病和9棵感病;2份M1突变体后代由于白粉病发病严重,没有发叶锈病。M1代为杂交种且M2代没有发生表型分离的突变体共82份。(6)选择39棵感病突变体创建作图群体。我们在M2群体中随机选择M1代为杂交种且M2代高感的39棵独立突变体。以这39棵突变体为母本,Lr29NIL为父本做杂交,通过回交创建分离作图群体,可用于开展Lr29基因的定位及克隆研究。(7)7E染色体特异分子标记的开发。我们依据中国春参考基因组中7D染色体短臂上的基因,在其外显子处设计引物;筛选能在Lr29NIL、CB037和Fielder扩增出条带的引物。对扩增片段测序后寻找Lr29NIL、CB037和Fielder处基因的序列差异,最后根据差异位点设计共显性的In Del引物。根据此方法我们设计了5个7E染色体特异的In Del标记。

芸苔属作物变异的标记数据库的构建

这是一篇关于芸薹属,分子标记,数据库,生物信息学的论文, 主要内容为芸薹属是十字花科植物中经济价值最大的一个属,包含了如白菜和甘蓝等重要的蔬菜作物以及油菜等世界主要的油料作物,提供了全球约10%的蔬菜和12%的植物食用油。进入21世纪以来,随着生物信息技术的发展和测序手段的进步,基因组数据、全基因组重测序数据和转录组数据大量出现,不同的研究团队针对不同的研究领域开发了一系列不同的生物数据库。此外,分子标记技术已经广泛应用于芸薹属作物的遗传育种、基因定位、基因克隆、基因组作图和物种亲缘关系鉴别等各个领域,而指数级增长的芸薹属作物重测序数据在管理、分析和挖掘上需要大量依赖于编程或命令行的生物信息工具来解决。然而,对于绝大多数生物学家和植物育种家来,编程环境和命令行执行是非常耗时和难以操作的,而且关于芸薹属物种的分子标记数据库也是一片空白。因此,我们以SNP和In Del分子标记为基础,构建了芸薹属作物变异的标记数据库。本文以Python编程语言为开发基础,以MySQL数据库为后台数据管理系统,采用B/S架构,通过对芸薹属中白菜、甘蓝和甘蓝型油菜三种作物的VCF(Variant Call Format)文件和重测序数据收集处理,构建起一个提供位点查询标记、基因查询标记、序列查询标记等多种检索标记方式的芸薹属作物变异标记数据库,方便用户快速准确的查找和浏览分子标记信息。本文工作取得的研究成果主要包含以下三个方面:(1)构建了芸薹属作物变异标记数据库BRAD Marker(http://brassicadb.cn/#/marker)。通过文献检索和整合多个数据集,我们共收集了芸薹属中白菜、甘蓝和甘蓝型油菜重测序数据732份,利用gatk和VCFtools等生物信息软件从重测序数据中获取变异信息,然后借助Primer3和BLAST等软件开发In Del标记共203,901个,SNP标记652,653个。其中白菜引物365,395对,甘蓝引物700,807对,油菜引物963,281对。通过整合基因注释信息,计算每对标记Tm值,添加SSR标记等信息,每一个分子标记都包括变异数据、引物数据和注释数据,构建了一个专注于芸薹属作物的分子标记生物数据库。(2)搭建了网页BLAST序列比对和JBrowse基因组数据可视化工具。在网页BLAST中,我们收集了十字花科物种不同版本基因组共35个,提供了核酸数据库和蛋白数据库的比对查询。在Jbrowse基因浏览器中,我们搭载了不同物种的参考基因组、已过滤的VCF文件、基因注释文件,更为重要的是对分子标记信息的可视化,用户点击分子标记图示,网页就会提供分子标记信息的引物长度和引物序列等数据。此外也能清楚的查看变异信息的变异类型、变异位点和该变异的具体参数。(3)开发了在线引物设计功能。我们利用成熟的标记开发流程对用户上传的文件进行引物设计。用户在使用该功能之前需要进行注册、激活和登录,用户在登陆之后数据库就能将设计好的引物结果发送至用户的邮箱中。此外,我们还开发了用户上传多态性标记的功能,我们鼓励用户下载标记上传模板文件并按照模板文件填写引物信息上传至网站。在数据库管理人员核查之后录入本数据库中。

芸苔属作物变异的标记数据库的构建

这是一篇关于芸薹属,分子标记,数据库,生物信息学的论文, 主要内容为芸薹属是十字花科植物中经济价值最大的一个属,包含了如白菜和甘蓝等重要的蔬菜作物以及油菜等世界主要的油料作物,提供了全球约10%的蔬菜和12%的植物食用油。进入21世纪以来,随着生物信息技术的发展和测序手段的进步,基因组数据、全基因组重测序数据和转录组数据大量出现,不同的研究团队针对不同的研究领域开发了一系列不同的生物数据库。此外,分子标记技术已经广泛应用于芸薹属作物的遗传育种、基因定位、基因克隆、基因组作图和物种亲缘关系鉴别等各个领域,而指数级增长的芸薹属作物重测序数据在管理、分析和挖掘上需要大量依赖于编程或命令行的生物信息工具来解决。然而,对于绝大多数生物学家和植物育种家来,编程环境和命令行执行是非常耗时和难以操作的,而且关于芸薹属物种的分子标记数据库也是一片空白。因此,我们以SNP和In Del分子标记为基础,构建了芸薹属作物变异的标记数据库。本文以Python编程语言为开发基础,以MySQL数据库为后台数据管理系统,采用B/S架构,通过对芸薹属中白菜、甘蓝和甘蓝型油菜三种作物的VCF(Variant Call Format)文件和重测序数据收集处理,构建起一个提供位点查询标记、基因查询标记、序列查询标记等多种检索标记方式的芸薹属作物变异标记数据库,方便用户快速准确的查找和浏览分子标记信息。本文工作取得的研究成果主要包含以下三个方面:(1)构建了芸薹属作物变异标记数据库BRAD Marker(http://brassicadb.cn/#/marker)。通过文献检索和整合多个数据集,我们共收集了芸薹属中白菜、甘蓝和甘蓝型油菜重测序数据732份,利用gatk和VCFtools等生物信息软件从重测序数据中获取变异信息,然后借助Primer3和BLAST等软件开发In Del标记共203,901个,SNP标记652,653个。其中白菜引物365,395对,甘蓝引物700,807对,油菜引物963,281对。通过整合基因注释信息,计算每对标记Tm值,添加SSR标记等信息,每一个分子标记都包括变异数据、引物数据和注释数据,构建了一个专注于芸薹属作物的分子标记生物数据库。(2)搭建了网页BLAST序列比对和JBrowse基因组数据可视化工具。在网页BLAST中,我们收集了十字花科物种不同版本基因组共35个,提供了核酸数据库和蛋白数据库的比对查询。在Jbrowse基因浏览器中,我们搭载了不同物种的参考基因组、已过滤的VCF文件、基因注释文件,更为重要的是对分子标记信息的可视化,用户点击分子标记图示,网页就会提供分子标记信息的引物长度和引物序列等数据。此外也能清楚的查看变异信息的变异类型、变异位点和该变异的具体参数。(3)开发了在线引物设计功能。我们利用成熟的标记开发流程对用户上传的文件进行引物设计。用户在使用该功能之前需要进行注册、激活和登录,用户在登陆之后数据库就能将设计好的引物结果发送至用户的邮箱中。此外,我们还开发了用户上传多态性标记的功能,我们鼓励用户下载标记上传模板文件并按照模板文件填写引物信息上传至网站。在数据库管理人员核查之后录入本数据库中。

小麦抗叶锈病基因Lr29作图群体的创制及分子标记开发

这是一篇关于小麦叶锈病,Lr29基因,EMS诱变,基因克隆,分子标记的论文, 主要内容为小麦是世界上重要的粮食作物之一,但小麦叶锈病严重威胁小麦的产量安全。小麦叶锈病(wheat leaf rust)是由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦重要病害之一。防治叶锈病主要依靠化学防治或栽培抗病品种,而培育抗病品种是防治叶锈病最为安全、有效的方法。然而由于不断变异产生新的叶锈小种,导致很多抗叶锈病基因逐渐丧失了抗病性。小麦抗叶锈病基因Lr29是一个全生育期抗病基因(ASR),来源于长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum),对我国叶锈小种具有高水平抗性,而且在生产上尚未被利用,具有重要的应用潜力。由于Lr29基因位于长穗偃麦草易位染色体7E,与普通小麦7D染色体不能正常配对,难以开展连锁分析。为了创建分离群体,并最终克隆该基因,本研究采用EMS(甲基磺酸乙酯)试剂诱变F1杂交种,获得感病突变体并与抗病亲本Lr29NIL回交创建作图群体,并开发了5个7E染色体特异分子标记。本研究为克隆Lr29基因奠定了基础,也为该基因抗病育种提供便于检测的分子标记。本研究的主要结果有:(1)抗叶锈病基因Lr29的初定位。利用Lr29NIL和Delibab的杂交后代群体,在F4代选取了5棵抗病植株和9棵感病植株组成极端性状混池,开展了小麦660k SNP芯片分析。统计纯合多态性SNPs在染色体上的分布,结果显示大部分定位在7D染色体,7D染色体末端4.8-5.8Mb范围内SNP密度最高。(2)Lr29是显性抗叶锈病基因。抗叶锈病的Lr29NIL材料和感叶锈病的CB037、Fielder杂交,选择了12粒F1种子,在苗期接叶锈菌,发现杂交种叶片上没有反应,为免疫类型(等级“0”),而对照CB037则有大量的孢子堆出现,为高感类型(等级“4”)。表明Lr29是一个显性抗叶锈病的基因。(3)EMS诱变处理。为了能快速获得较多的感病突变体,我们选择用EMS诱变Lr29NIL和CB037、Fielder的杂交种共约6600粒。预实验设计了0、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%共5个EMS浓度梯度,每个梯度用100粒杂交种,预实验确定杂交种的半致死浓度为0.4%。为了保证诱变效率,我们选了用0.45%的EMS诱变剩余的6100粒杂交种。(4)M1感病突变体的表型和基因型鉴定。EMS诱变后共获得突变体约2000棵,在苗期接叶锈菌表型鉴定,共筛选得到104棵高感叶锈病的突变体,其中94棵收获得到种子。我们根据一个纯合多态性SNP(AX-95235261)位点,开发了能区分Lr29NIL和CB037、Fielder的分子标记,并命名为LGM1。用该标记鉴定94棵感病突变体,基因型显示其中86棵突变体为杂交种。(5)M2突变体的表型和基因型鉴定。从94份感病M1代突变体中,每份选择10粒种子构成M2群体共690棵。在苗期接叶锈菌表型鉴定,其中89份M1突变体后代全部高感;3份M1突变体后代表型分离16棵抗病和9棵感病;2份M1突变体后代由于白粉病发病严重,没有发叶锈病。M1代为杂交种且M2代没有发生表型分离的突变体共82份。(6)选择39棵感病突变体创建作图群体。我们在M2群体中随机选择M1代为杂交种且M2代高感的39棵独立突变体。以这39棵突变体为母本,Lr29NIL为父本做杂交,通过回交创建分离作图群体,可用于开展Lr29基因的定位及克隆研究。(7)7E染色体特异分子标记的开发。我们依据中国春参考基因组中7D染色体短臂上的基因,在其外显子处设计引物;筛选能在Lr29NIL、CB037和Fielder扩增出条带的引物。对扩增片段测序后寻找Lr29NIL、CB037和Fielder处基因的序列差异,最后根据差异位点设计共显性的In Del引物。根据此方法我们设计了5个7E染色体特异的In Del标记。

菜豆Mutator转座元件的注释、标记开发及应用

这是一篇关于菜豆,Mutator转座元件,生物信息学,分子标记,种质资源鉴定的论文, 主要内容为菜豆(Phaseolus vulgaris)是一种重要的蔬菜作物,在全世界范围内被人们广泛种植,具有很高的营养价值和经济价值。菜豆种质资源鉴定可延缓和解决菜豆品种退化和品种混乱等一系列问题。Mutator转座元件是拷贝数最多的DNA转座子之一,具有广泛分布、拷贝数多、转座频率高、多态性高、易用性以及功能基因关联密切等特征,符合分子标记开发的特点。因此,本研究基于结构寻找和同源比对的方法,在两个不同的菜豆基因组中系统鉴定Mutator转座元件,主要研究内容包括元件数量、元件插入偏向性、在染色体上的分布特征以及系统发育分析,然后基于菜豆Mutator元件开发分子标记,试图建立一种新型的方法来鉴定菜豆种质资源以解决菜豆品种退化和品种混乱等问题。本研究为菜豆种质资源鉴定提供了一条可行性方法,为培育品质优良,产量可观的新品种提供理论依据。主要结果如下:1.菜豆基因组中Mutator转座元件的鉴定和数量分析基于结构特征寻找和同源比对的方法,从菜豆G19833基因组中鉴定出2040个边界清楚、插入位置明确、结构相对完整的Mutator转座元件。在BAT93基因组中鉴定出2130个Mutator转座元件。两个基因组中Mutator转座元件数量相差不大,但两者之间都含有各自特有的Mutator转座元件。在G19833基因组中鉴定出158个特有的元件,在BAT93中鉴定出124个特有的元件。对G19833基因组中的Mutator元件进行分析发现,这些元件总长度约2.07 Mb,有84%的元件长度<1 Kb范围内,最小元件只有179 bp,而最长元件高达10872 bp。2.菜豆Mutator转座元件插入偏向性分析对G19833基因组中所有Mutator元件两边的侧翼序列各20 bp和9 bp靶位点重复序列TSD(Target Site Duplication,TSD)进行统计分析,在9 bp TSD位置上的GC平均含量约24%,远低于49个碱基的平均GC含量约31%和整个菜豆基因组GC含量的36%。Mutator转座元件的插入位点具有很强的偏向性,明显偏向插入GC较少的区域。同时,Mutator转座元件密度与功能基因密度之间呈显著的正相关性。3.菜豆Mutator转座元件系统发育分析对菜豆G19833基因组中所有含Mutator转座酶的Mutator元件进行系统发育分析发现,它们大致分为五支。其cladeⅠ、cladeⅢ和cladeⅤ进化支非常丰富,含酶元件数也相对较多。cladeⅡ进化支包含2个含酶元件和2个家族,相对前面三个分支,此分支在进化中相对稳定。但cladeⅣ进化支只有一个含酶元件且该元件的家族是拷贝数最丰富的家族Family 1。4.基于菜豆Mutator转座元件开发分子标记,并应用于种质资源鉴定基于菜豆Mutator转座元件广泛分布、拷贝数多、转座频率高,多态性高及相对缺乏插入特异性等特征开发分子标记。根据菜豆两个基因组中特有Mutator元件各随机设计了25对引物,选取了32份不同区域的菜豆品种作为供试品种,进行种质资源鉴定。参考经过PCR扩增后的结果,筛选出13对核心引物,能够将所有菜豆品种区分,区分率高达100%。还对这32份菜豆品种进行了遗传相似性分析,32份菜豆品种之间遗传相似系数在0.24～0.88之间,平均遗传相似系数0.56。在遗传相似系数0.24处将32份菜豆品种划分为2个大类,在遗传相似系数0.45处将所有菜豆品种分为四个亚类。最后根据条带的有或无,构建了唯一的分子身份证代码,可以更直观、方便简洁的区分不同菜豆种质。以上结果表明,菜豆基因组中Mutator转座元件符合分子标记开发的特征。此标记技术可应用于菜豆种质资源鉴定,可以为菜豆品种选育工作提供选择依据,为培育优质、高产品种提供分子支撑。