基于ICT机理荧光探针的设计及用于细胞器微环境的成像研究
这是一篇关于荧光探针,粘度,SO2,极性,脂滴,线粒体的论文, 主要内容为有机小分子荧光探针具有实时原位无侵入式监测活细胞中生物分子的独特性能,在生命医学领域是一个强有力的工具。其中分子内电荷转移(ICT)是构建荧光探针分子常用的机理,D-π-A结构是典型ICT机理中的重要组成成分。基于此原理的探针通常包含拉电子基团(Acceptor)和推电子基团(Donor),两部分由共轭型连接基团相连,通过分子内电子转移的过程,使分子处于电荷转移态,通过荧光信号的变化,实现对分析物的检测,例如SO2,CO等气体信号分子,微环境中的粘度和极性。粘度是衡量细胞微环境状态的重要因素之一,它影响着细胞间物质的扩散速率。细胞粘度水平的变化可诱发各种疾病或引起生理紊乱,如高血压、糖尿病、动脉粥样硬化和恶性肿瘤,因此开发一种可以检测粘度的工具对生物应用具有重要意义。与粘度一样,极性也是检测细胞微环境变化的重要参数。通常在肿瘤细胞的极性正常细胞有所区别,因此,我们可以通过对细胞极性的参数的检测以实现对疾病的诊断,即开发一种可以检测细胞极性的工具对生物应用具有重要意义。SO2是一种气体信号分子,也是一把双刃剑。正常浓度的SO2在体内可以调节心血管功能、控制炎症反应、维持细胞内氧化还原平衡等。过量摄入外源性SO2会产生呼吸不足、过敏等不适的生理反应,还会破坏人体的正常代谢,进而导致肺癌、心血管疾病和许多神经系统疾病。CO与SO2类似,也属于一种气体信号分子,适量的CO能舒张血管和调节血压、防御感染和抑制炎症反应。过量的CO会引发人体中毒,休克和器官衰竭。目前关于CO和SO2的相互作用机制仍不完全清楚,因此开发一种可以同时监测CO和SO2含量的工具对生物医学应用具有重要意义。在本文中,基于ICT机理分别设计合成了可以同时检测SO2和粘度的脂滴靶向荧光探针A-XB;同时检测SO2和CO的荧光探针KM-D和检测SO2的荧光探针WA-C;检测极性的荧光探针XY-CN和荧光探针XY-CNN。(一)基于ICT机理,设计了一种具有推拉电子效应的荧光探针A-XB。将萘酰亚胺作为荧光团,和吲哚盐通过C=C连接构成共轭体系。该探针对粘度敏感,随着粘度的增加,在647 nm处红色荧光增强;随着SO2的加入,647 nm处的荧光减弱,在540 nm处的荧光增强;也可在粘度条件下通过供体1,8-萘酰亚胺和受体吲哚盐的分子内电荷转移(ICT)过程检测SO2。A-XB具有与SO2反应后具有良好的比率特性、长发射(647 nm)、高选择性、低检测限和快速识别(<10 s)。此外,探针也可以用于He La和Hep G2细胞中SO2和粘度的成像研究。(二)基于ICT机理以香豆素为荧光团,分别设计合成了可同时检测SO2和CO的荧光探针KM-D、可识别活细胞内外源性SO2的比率型荧光探针WA-C。探针WA-C在没有SO2的情况下,探针在672 nm处发出强烈的红色荧光,在有SO2的情况下,由于双键的断裂,ICT机制被破坏,导致在507 nm处发出绿色荧光,探针的荧光发生蓝移。该探针实现了对SO2优异的特异性和短的识别时间。在细胞中,探针WA-C可以从外源和内源两个方面检测SO2。(三)基于ICT机理以二甲氨基萘甲醛为荧光团,分别设计合成了两种识别极性的荧光探针XY-CN和XY-CNN。随着溶剂极性的增加,探针XY-CNN的发射峰由555 nm逐渐红移至675 nm。同时,由于ICT效应,荧光量子产率随溶剂极性的增加而降低,这些结果表明探针XY-CNN对环境极性敏感。探针XY-CNN可特异性定位脂滴,具有脂滴染色特异性和良好的光稳定性,可用于三维共聚焦成像和对脂滴空间分布的可视化。此外,光谱扫描成像显示这种极性敏感的荧光探针也可定量地确定脂滴的极性。
新型酰肼希夫碱荧光探针的设计合成及传感性能研究
这是一篇关于荧光探针,铝离子,铜离子,硫化氢,人血清白蛋白,荧光成像的论文, 主要内容为荧光探针技术由于其具有操作便捷、高灵敏度、高选择性、实时监测和快速响应等优点,已被广泛应用于医药、环境、食品等行业中。荧光探针分子作为一种能够获取生物体系内重要化学生物信息的关键技术手段,其开发可为生命科学领域提供高效快速的目标信息获取技术,并在众多研究领域中显示出广阔的应用前景。铝(Al3+)与我们的生活密切相关,在食品、药品以及制造业等方面被广泛应用。然而,长期暴露于高浓度的铝离子环境中,不仅会损害植物的根,抑制其生长,对人体的肾脏器官、大脑等也有极大的影响,会导致阿尔茨海默病、脑病、肌病等各种神经退行性疾病。铜(Cu2+)对多种与人类健康有关的基本的病理和生理过程起着突出作用。铜离子浓度异常可打破机体内众多物质的动态平衡,进而会引起多种神经退行性疾病以及对肾脏器官产生毒性等。硫化氢(H2S)作为三种内源性气体信号传导分子中的一种,在神经系统、心血管系统、机体免疫系统等方面发挥着至关重要的作用。然而,持续暴露于不适当水平的H2S时会扰乱人体的正常生理功能,进而导致一系列严重的疾病,如心血管疾病、唐氏综合征、高血压、糖尿病和肝硬化等。人血清白蛋白(HSA)是重要的血浆蛋白之一,占血清总蛋白量的50%以上。白蛋白具有多种生理功能,在人体的生理过程中起着重要作用,包括维持血管和组织之间的血液胶体渗透压,结合并参与多种小分子物质的运输、代谢产物转运和再加工,还可能具有抗氧化以及清除自由基的功能。在健康人的尿液中白蛋白浓度低于30mg/L。尿中白蛋白排泄正常,尿常规检测中蛋白质定性实验为阴性,但尿中白蛋白浓度增加,即称之为微量蛋白尿。尿微量白蛋白是糖尿病肾病、高血压肾病等早期肾脏受损的标志,可作为医学诊断慢性肾病的生物标志物。因此,对Al3+、Cu2+、H2S和HSA的定性和定量检测在生命科学、分子生物学、临床医学等领域具有重要的研究意义,开发用于检测Al3+、Cu2+、H2S和HSA的荧光探针分子,在疾病预防和监测中具有重要的应用价值。目的:本研究内容旨在开发用于检测Al3+、Cu2+、H2S和HSA的酰肼希夫碱荧光探针分子,为金属离子和生物分子的检测提供可靠的分析手段和设计思路。本论文主要分为以下三个部分:(1)设计、合成异喹啉酰肼希夫碱荧光探针分子,用于选择性检测Al3+,并将其应用于细胞内Al3+的检测;(2)设计、合成苯甲酰肼希夫碱荧光探针分子,用于选择性测定Cu2+和S2-的双功能荧光传感器的设计及其性质研究,并将其应用于细胞和斑马鱼体内进行研究;(3)尿液中人血清白蛋白的检测:香豆素酰肼希夫碱荧光探针法及临床散射比浊法的研究。方法:分别选择不同的酰肼分子和醛类化合物,通过缩合反应将其连接在一起,合成得到三个新型酰肼希夫碱荧光探针分子,分别为HIC、NBD和NPC。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)、质谱(MS)和红外光谱法(IR)对探针分子HIC和NBD的结构进行表征。利用紫外-可见光谱法(UV-vis)和荧光光谱法对探针分子HIC和NBD的光学性质进行研究。通过计算机理论计算对HIC与Al3+、NBD与Cu2+以及NPC与HSA的结合机理进行研究。通过MTT法和生物成像法对其生物相容性进行研究,测定其在生物系统中的荧光响应性能。结果:设计、合成了两个新型的酰肼希夫碱荧光探针分子HIC和NBD。第一章深入研究了HIC对Al3+的检测性能。在激发波长为400 nm的激发下,探针分子HIC与Al3+在491 nm表现出明显的荧光发射信号,在其他干扰性物质的存在下,探针分子HIC仍可以与Al3+特异性响应。在乙醇溶液中,探针分子HIC对Al3+的检测限为1.71×10-9M。细胞毒性实验及生物成像结果表明探针分子HIC可以在生物体系中检测Al3+。第二章深入研究了NBD对Cu2+,以及其铜配合物对S2-的检测性能。利用S2-与Cu2+的结合性能,进而恢复NBD的荧光响应;通过荧光信号的“关-开”转换,实现了对Cu2+和S2-的选择性识别。在CH3OH-PBS(2 m L,V/V=1:1)缓冲溶液中,探针分子NBD对Cu2+检测限为1.47×10-8M,其铜配合物对S2-检测限为4.10×10-8M。细胞毒性实验及生物成像结果表明探针分子NBD及其铜配合物可以在生物体系中分别检测Cu2+和S2-。第三章在本课题组前期研究的基础上,进一步研究了NPC的结构与性质,并将其在尿液中白蛋白的检测性能与临床散射比浊法进行了比较,进一步评价了NPC在临床诊断中的应用性。结论:设计、合成的酰肼希夫碱荧光探针分子可以选择性地快速识别目标物,具有良好的荧光响应性能,并在生物体系中具有一定的应用价值。这一研究内容为后期构建基于酰肼希夫碱衍生物的荧光分析方法提供了新的设计思路和研究方法。
靶向转甲状腺素蛋白的荧光诊疗化合物的设计、构建及评价
这是一篇关于淀粉样沉淀,TTR四聚体蛋白,荧光探针,虚拟筛选,小分子抑制剂的论文, 主要内容为淀粉样变是一种因蛋白本身而产生的异常物质——淀粉体,在身体组织内异常沉积而导致的罕见性疾病。目前已知会形成淀粉样变的人体蛋白约有20多种,常见的有免疫球蛋白、β-淀粉样蛋白和转甲状腺素蛋白。转甲状腺素蛋白(TTR蛋白)主要由肝脏产生,通常是维生素A的转运蛋白。转甲状腺素蛋白淀粉样变性(ATTR),主要表现为可导致神经损伤的多发性神经病(ATTR-PN),或可导致心力衰竭的心肌病(ATTR-CM);其发病原理是由于不稳定的转甲状腺素蛋白异常解离并发生错误折叠,形成沉积于组织和器官的致病淀粉样物质,引起细胞毒性及进一步损伤。目前对疑似淀粉样变性患者的诊断缺乏特异性临床症状,同时检查步骤多、周期长、所需信息量大,病理学检查会损害人体组织。这很容易造成淀粉样病变的确诊延迟,患病人数被严重低估。在正常情况下,TTR蛋白以可溶性四聚体结构存在于血清中,通过荧光探针检测的方法将血清中的TTR蛋白含量定量,可以作为早期诊断淀粉样变的方法工具,对于ATTR淀粉样变性疾病早发现早诊断早治疗具有重要意义。长期以来,确诊后的患者治疗均以对症治疗为主,部分患者甚至需要进行肝心移植来进行治疗。如不及时进行对因治疗,平均生存时间仅为2～5年。目前上市的药物氯苯唑酸(Tafamidis)将通过小分子化合物使四聚体稳定,从而使TTR蛋白的解聚沉淀减少成为可能。基于此开发对因治疗双功能小分子诊疗化合物,同时实现对TTR四聚体蛋白的体外检测和体内稳定,为早期诊断治疗ATTR淀粉样变性提供了新的策略和工具。本论文以开发靶向转甲状腺素蛋白的小分子荧光诊疗化合物为目标,开展了以下三部分的工作:(1)基于喹啉-乙烯-苯胺衍生物结构开发了一种具有D-A-D体系和AIE特性的用于特异性识别和检测四聚体转甲状腺素蛋白的荧光探针QCN1。探针在水溶液和有机溶剂中均表现良好的荧光发射性质,对TTR四聚体蛋白具有高选择性、高灵敏度和强稳定性。通过化合物这些优良特性,该探针可能成为转甲状腺素蛋白淀粉样变领域中具有应用前景的诊断工具。(2)基于马来酰亚胺结构设计得到了一系列小分子荧光化合物,实现了对其荧光发射峰的规律性调节,荧光淬灭型小分子P5通过TTR蛋白特异性结合活性筛选得到,并具有抑制其淀粉样沉淀的活性。在此基础上成功开发出了对TTR蛋白识别抑制的双功能的小分子荧光化合物。(3)基于TTR蛋白的结构,利用虚拟筛选的手段获得一系列具有潜在活性的小分子化合物,因此通过评估抑制TTR淀粉样蛋白变性、促进Aβ淀粉样原纤维的解聚和作为小分子伴侣,通过稳定TTR蛋白并与Aβ蛋白形成抑制淀粉样蛋白聚集的三元复合物,最终筛选得到11号化合物。其对酸诱导的TTR蛋白淀粉样纤维抑制率为75.57±11.27%,对Aβ蛋白淀粉样纤维抑制率为68.55±0.81%,促进Aβ淀粉样纤维解聚率109.2±7.9%,具有进一步开发的价值潜力。
光气荧光探针的构建及检测器件研究
这是一篇关于光气,荧光探针,液态检测器件,膜滴液,荧光检测笔的论文, 主要内容为光气是一种剧烈窒息性毒气,同时又是重要的有机合成中间体,广泛应用于染料、塑料、农药和医药的合成中。构建灵敏的光气检测方法和开发满足实际检测需求的原位检测器件对于光气的实时监控和维护公共安全具有重要意义。荧光探针具有设计性强、灵敏度高以及可视化检测等特点,在分析物的实时检测中具有显著优势。近年来,基于荧光探针的光气检测方法受到大家的广泛关注。开发新型的光气荧光探针以提高探针检测的灵敏度、选择性和响应速度以及构建满足实际应用需求的检测器件是当前光气探针领域研究的热点。基于光气探针检测的实际需求,本研究合成了两种新型的罗丹明衍生物,结合2,3-二氨基吩嗪商业化探针,分别构建了猝灭型、打开型以及比率型三种检测模式的光气荧光检测方法。提出了基于偕胺肟进行光气检测的新型反应位点,提高了光气检测的选择性,为新型光气荧光探针及反应位点的设计提供了新的策略。基于现实生活中对气态光气实时检测的需求,通过对探针不同固载形式的研究,设计了基于液-气反应的液膜检测器件和光气荧光书写检测笔。所设计的液态传感器具有液相反应、固相观察的优点,实现了实时、原位的光气可视化检测。与传统的固态检测器件(试纸条、静电纺丝纤维及聚合物膜等)相比,液态检测器件克服了固-气之间反应慢、灵敏度不高的缺点,为光气检测器件的开发提供了新的思路。具体研究内容如下:1.基于2,3-二氨基吩嗪的猝灭型光气荧光快检方法及液膜检测器件研制以2,3-二氨基吩嗪(P1)为荧光探针,基于其邻苯二胺单元与光气的反应特性构建了一种猝灭型的光气快检方法。该方法在溶液中检测光气的线性范围为0-5 μM,检测限为99.78 nM。通过对探针固载模式探究,构建了光气可视化液态检测器件。该器件克服了固态检测器件反应慢的问题,在2 min内即可出现黄绿色到橘黄色的视觉变化,最小裸眼检出量为5 ppm,满足实际检测的需求。本研究基于商业化2,3-二氨基吩嗪构建的比色及荧光猝灭可视化检测方法,具有探针易于获得,瞬时响应的特点,有望在光气实际快检中投入应用。2.基于偕胺肟新型反应位点的比率型光气荧光检测方法及液膜检测器件研制通过罗丹明800与羟胺一步室温反应,制备了具有偕胺肟结构的罗丹明衍生物(P2)。光气可与偕胺肟位点发生特异性识别响应,生成具有更长荧光发射的环状恶二唑产物,反应可在2 s内完成。基于上述特异性反应产生的荧光光谱变化,构建了一种比率型光气荧光快检方法,线性范围为0-50 μM,检测限为34.65 nM。相对于报道的方法,该探针可以更好区分光气和其它活性酰氯化合物,表现出更为优异的选择性。同时基于P2的液膜器件,可实现快速灵敏的比色及荧光检测,裸眼检出量为5 ppm。本研究首次提出了基于偕胺肟进行光气检测的新型反应位点,为光气反应位点的设计提供了参考。3.基于罗丹明开关环反应的荧光打开型光气快检方法及快速检测笔研制基于罗丹明的螺环开关性质设计了一种新型的罗丹明衍生物P3。在光气的作用下探针P3经历螺开环反应恢复罗丹明的荧光,可实现对光气的比色及打开型荧光检测。光气浓度在2-7 μM范围内与荧光强度呈现良好的线性关系,具有超高的灵敏度,检测限为26 pM。打开型荧光检测模式,不存在背景荧光的干扰,提高了检测的灵敏度更有利于光气的可视化检测。通过探针与聚苯乙烯的共混及笔芯装载,研制了便携的光气荧光书写检测笔,成功用于气态光气的比色及荧光双信号检测,可裸眼检出2 ppm的气态光气。该检测笔操作简单、“即写即测”,且结合智能手机拍照及RGB分析,实现了光气的原位快速定量分析,为光气的实时原位检测提供了依据。
内滤效应及罗丹醇基席夫碱荧光探针的研究
这是一篇关于荧光探针,消光系数差别内滤光法,罗丹醇,席夫碱,水含量,1,4-丁二胺的论文, 主要内容为荧光探针具有通用性强、灵敏度高、操作简单、响应快、成本低等优点,广泛应用于各种物质的检测,尤其是非损伤的检测方式非常适用于生物活体的检测。近年来,越来越多的荧光机理被应用于荧光探针的设计开发。基于内滤效应(IFE)的传感方法由于不需要吸收剂和荧光团之间的任何共价或非共价连接,降低了有机合成的难度,并且表现出明显的简单性和可调节性,以及省时和经济的优点。但遗憾的是,因为任何在激发波长处有吸收的化合物都会过滤荧光团的激发光从而干扰检测,导致探针的选择性相对较差,这使此类探针的应用范围受到了很大的限制。本论文的第一部分在现有的IFE荧光探针方法的基础上,提出了一种消光系数差别内滤光法(εDIFM),该方法可以在激发波长处有吸收的干扰物质存在的情况下,选择性的识别被分析物。为了验证该方法,本论文应用εDIFM开发了一种选择性检测2,4,6-三硝基酚(TNP)的方法。该方法选用商用罗丹明染料Rh B作为荧光团,以观察薄层色谱所使用的紫外灯的波长(365 nm)作为激发波长,通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究了其选择性、抗干扰性、线性范围及检测限。测试结果显示,该方法对TNP的线性检测范围为0-260μM,线性相关系数(R2)为0.99674,检测限(DL)为0.088μM。即使存在和TNP同样在365 nm处有吸收的物质,如2,4-二硝基苯胺(2,4-DTA)、4-硝基苯胺(4-TA)、2,4-二硝基苯肼(2,4-DTH),基于εDIFM的方法也能选择性识别TNP。目前在文献报道的所有基于IFE的TNP检测方法中,εDIFM法是选择性最好的方法。应用该方法可以实现在实际水样中检测TNP。此外,开发了TNP试纸,并将试纸与智能手机颜色识别器App相结合,建立了一种低成本、实时、现场的TNP定量分析方法。罗丹醇(rhodol)是罗丹明和荧光素结构的融合体,它继承了荧光素和罗丹明的优良光物理性质,例如高消光系数、量子产率、光稳定性等,同时具有易于修饰、在各种溶剂中溶解性好等化学性质。近年来基于罗丹醇(rhodol)结构的荧光探针逐渐成为研究热点。本论文第二部分以甲酰基罗丹醇(RHO-CHO)为母体,设计合成了罗丹醇-席夫碱基探针RHO-C=N-1、RHO-C=N-2,通过核磁共振氢谱、碳谱及高分辨质谱确定了其结构。探针RHO-C=N-1中-C=N-与H2O发生亲核反应使荧光发射发生蓝移从而实现乙醇中水含量的检测,紫外-可见吸收光谱和荧光光谱实验表明探针可以实现对乙醇含水量的灵敏检测,线性范围为0-18%(v/v),检测限低至0.032%。同样以-C=N-为识别位点,探针RHO-C=N-1和探针RHO-C=N-2可以选择性识别二胺。紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱、核磁共振氢谱和碳谱研究结果表明探针RHO-C=N-1和探针RHO-C=N-2均对1,4-丁二胺具有较好的选择性识别能力和抗干扰能力,线性范围均为0-45μM,检测限分别为0.47μM、0.79μM。此外,还开发了四种固态指示器(分别为含探针RHO-C=N-1和探针RHO-C=N-2的滤纸和TLC板),可以实现对鱼、虾的新鲜度的现场快速检验。
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