冬眠达乌尔黄鼠膈肌肥大和腓肠肌萎缩的差异性调控机制

这是一篇关于冬眠,蛋白代谢,再生,骨骼肌,差异性适应的论文, 主要内容为研究背景及目的:骨骼肌具有高度可塑性的特点,其能够随着环境的改变而发生适应性变化。在冬眠哺乳动物中,骨骼肌的维持表现出不同的肌肉特异性。肌纤维大小的变化与蛋白代谢的平衡密切相关,当蛋白合成大于蛋白降解时引起肌肉肥大,当蛋白降解大于蛋白合成时导致肌肉萎缩。此外,当肌肉损伤时,会激活肌肉的再生潜能来进行修复。因此,在本研究中,我们选取了夏季活跃组和冬眠组达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)的两种快缩型肌肉——膈肌和腓肠肌,对蛋白代谢和肌肉再生调节的差异是否参与了冬眠达乌尔黄鼠肌肉肥大与萎缩的相反表型适应机制进行探究。研究方法:以夏季活跃组(summer active group,SA)和冬眠组(hibernation group,HIB)达乌尔黄鼠的膈肌(diaphragm)和腓肠肌(gastrocnemius)为研究对象,通过冰冻切片技术和免疫荧光染色法测定了肌纤维横截面积(CSA)和肌纤维类型分布;通过western blot技术测定了蛋白降解途径中钙蛋白酶降解途径相关分子(calpain-1,calpain-2,calpastatin,desmin和troponin T)、泛素-蛋白酶体途径相关分子(Mu RF1和atrogin-1)、自噬-溶酶体途径相关分子(Beclin1和LC3-II),蛋白合成途径中Akt-m TOR信号通路相关分子(P-Akt,P-m TORC1,P-S6K1和P-4E-BP1),以及肌肉再生相关分子(Myo D,myogenin和myostatin)的蛋白表达水平变化;通过酶活力测定法检测了糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性。研究结果:形态学结果显示,与夏季活跃组黄鼠相比,冬眠组黄鼠膈肌肌重和肌纤维横截面积均显著上升,而在腓肠肌中二者均显著下降。此外,相较于夏季活跃组,冬眠组黄鼠膈肌的MHC I型、MHC IIb型和MHC IIx型肌纤维比例均显著增加,MHC IIa型肌纤维比例则显著下降,腓肠肌的MHC I型、MHC IIa型、MHC IIx型肌纤维比例均显著增加,而MHC IIb型肌纤维比例显著下降。在蛋白降解途径中,相较于夏季活跃组,钙蛋白酶途径的标志分子calpain-1、calpain-2和desmin蛋白表达水平在冬眠黄鼠膈肌中显著降低,而在腓肠肌中显著升高;相反的是,与夏季活跃组相比,冬眠黄鼠calpastatin蛋白表达水平在膈肌中显著升高,而在腓肠肌中显著降低;此外,与夏季活跃组黄鼠相比,冬眠黄鼠钙蛋白酶的底物troponin T蛋白表达水平则在膈肌和腓肠肌中均无显著变化。相较于夏季活跃组,泛素-蛋白酶体途径的标志分子Mu RF1和atrogin-1蛋白表达水平、以及糜蛋白酶和胰蛋白酶活性在冬眠黄鼠膈肌中均显著降低,而在腓肠肌中均显著升高。除此之外,自噬相关蛋白Beclin1和LC3-II的蛋白表达水平相较于夏季活跃组,在冬眠黄鼠膈肌中均显著升高,而在腓肠肌中均显著下降。在蛋白合成途径中,与夏季活跃组相比,冬眠黄鼠Akt-m TOR信号通路相关标志分子P-Akt,P-m TORC1,P-S6K1和P-4E-BP1的蛋白表达水平在膈肌中均显著升高,而在腓肠肌中均显著降低。在肌肉再生途径中,与夏季活跃组相比,其关键调控分子Myo D和myogenin的蛋白表达水平在冬眠黄鼠膈肌中均显著升高,而在腓肠肌中均显著降低,而myostatin的蛋白表达水平在膈肌中显著下降,而在腓肠肌中显著升高。研究结论:冬眠黄鼠膈肌质量增加,腓肠肌质量减少,此外,膈肌和腓肠肌在冬眠中均表现出明显的由快向慢的肌纤维类型过渡,说明并不是所有的骨骼肌质量在冬眠黄鼠中都保持不变,不同类型的骨骼肌表现出不同的适应性特征和机制。我们的研究结果进一步表明,冬眠期黄鼠膈肌中蛋白合成增加、蛋白降解减少,以及肌肉再生潜力的增加相互协调,是导致其肥大的主要机制;而蛋白合成减少、蛋白降解增加和肌肉再生潜力的降低则参与了腓肠肌萎缩机制。综上所述,蛋白代谢和肌肉再生的差异调控模式可能参与了达乌尔黄鼠膈肌和腓肠肌不同的适应性变化。

冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨胳肌线粒体钙浓度的变化及调控机制研究

这是一篇关于冬眠,废用性肌萎缩,骨骼肌,钙单向转运体,亮氨酸拉链-EF-手型跨膜蛋白1的论文, 主要内容为研究背景:线粒体钙超载会增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,并伴随着增加非特异性内膜通透性的风险,使线粒体膜电位去极化,致使细胞凋亡或坏死,引起肌肉萎缩。本课题组前期研究发现,冬眠达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)的典型慢肌比目鱼肌在冬眠不同时期线粒体钙浓度没有发生显著变化,典型的快肌趾长伸肌在冬眠期间出现显著的钙超载现象,并且出眠时没有恢复至冬眠前水平,其他骨骼肌在冬眠不同时期的线粒体钙浓度变化规律及其调控机制尚未明了。单向转运体复合物是线粒体摄钙通道中最重要的复合物,线粒体钙单运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是复合物中的关键通道蛋白,可以顺化学梯度摄取钙离子。线粒体钙摄取蛋白1(mitochondrial calcium uptake,MICU1)和线粒体钙摄取蛋白2(mitochondrial calcium uptake,MICU2)是MCU的调控蛋白,调控机制受钙浓度影响。依赖亮氨酸拉链-EF-手型跨膜蛋白1(leucine zipper-EF-hand containing transmembrane protein 1,Letm1)是一种线粒体内膜蛋白,可以介导钙离子的排出,对线粒体钙的动态平衡起关键作用。本研究通过测定达乌尔黄鼠不同骨骼肌在不同时期的线粒体钙浓度变化及摄钙蛋白MCU、摄钙调控蛋白MICU1和MICU2,以及排钙蛋白Letm1的基因和蛋白水平表达探索线粒体钙浓度的变化规律及其调控机制。研究目的:1.通过检测达乌尔黄鼠不同骨骼肌在冬眠不同时期的线粒体钙浓度变化,探索达乌尔黄鼠不同骨骼肌在不同时期的线粒体钙浓度变化规律。2.通过测量达乌尔黄鼠不同骨骼肌在冬眠不同时期摄钙蛋白MCU、摄钙调控蛋白MICU1和MICU2,以及排钙蛋白Letm1的基因和蛋白水平表达,探索线粒体钙浓度变化的调控机制。研究方法:1.以夏季活跃组(summer active group,SA)、冬眠前组(pre-hibernation group,PRE)、浅冬眠组(early torpor group,ET)、深冬眠组(late torpor group,LT)、阵间觉醒组(interbout arousal group,IBA)及出眠组(post-hibernation group,POST)六组黄鼠的跖肌(plantaris longus,PL)、外侧腓肠肌(lateral gastrocnemius,LG)及半腱肌(semitendinosus,ST)为实验对象,采用单根肌纤维分离技术和激光共聚焦技术测定黄鼠不同时期不同骨骼肌线粒体钙浓度的变化。2.通过实时荧光定量PCR测定不同骨骼肌线粒体钙通道蛋白MCU、MICU1、MICU2和Letm1的基因水平变化。3.通过Western Blot测定不同骨骼肌线粒体钙通道蛋白MCU、MICU1和Letm1的蛋白水平变化。研究结果:1.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌的线粒体钙浓度变化与IBA组相比,浅冬眠组的黄鼠腓肠肌线粒体钙浓度下降了4.34%(P<0.05),其余各组无明显差异;黄鼠跖肌的线粒体钙浓度在IBA时期略有升高,但没有统计意义。在冬眠不同时期均没有显著差异;与PRE组和IBA组相比,黄鼠半腱肌的线粒体钙浓度在EL组分别升高了5.99%(P<0.01)和3.29%(P<0.01)。2.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌线粒体钙通道蛋白的基因和蛋白水平表达(1)腓肠肌m RNA相对表达量:与SA组相比,MCU m RNA在LT(70.06%,P<0.01),POST(91.53%,P<0.001)组均升高;IBA和ET时期MICU1(IBA(31.2%,P<0.05),ET(49.35%,P<0.01)),MICU2(IBA(55.97%,P<0.01),ET(66.05%,P<0.001)),Letm1(IBA(47.64%,P<0.05),ET无变化)m RNA表达均降低。与SA和PRE相比LT和POST时期MICU1,MICU2,Letm1 m RNA表达均不同程度升高。(2)腓肠肌蛋白表达水平:与SA组相比,IBA组MCU、MICU1和Letm1蛋白表达分别降低了44.69%(P<0.01),34.15%(P<0.001),52.8%(P<0.01),POST组不同程度的升高,但未出现显著差异。与PRE组相比,冬眠阵三组和出眠组MICU1(IBA(23%,P<0.05),ET(40.23%,P<0.001),LT(39.1%,P<0.001),POST(34.48%,P<0.001)),Letm1(IBA无变化,ET(30.66%,P<0.01),LT(25.78%,P<0.05),POST(23.72%,P<0.05))蛋白表达均出现不同程度的降低,与IBA组相比,Letm1在ET组(34.55%,P<0.01),LT组(29.97%,P<0.01),POST组(22.38%,P<0.01)均出现显著降低。(3)跖肌m RNA相对表达量:与SA和PRE组相比,IBA和ET时期MCU,MICU1,MICU2 m RNA表达均不同程度降低,Letm1 m RNA表达没有变化。与SA组相比,MCU、MICU2、Letm1 LT时期m RNA表达分别升高48.93%(P<0.05),107.8%(P<0.001),91.67%(P<0.05);POST组MCU(49.4%,P<0.05),MICU2(73.35%,P<0.01)m RNA表达显著升高,MICU1,Letm1 m RNA表达没有变化。(4)跖肌蛋白表达水平:与SA相比,IBA和ET时期MCU(IBA无变化,ET(39.58%,P<0.01)),MICU1(IBA(64.98%,P<0.05),ET(81.09%,P<0.05)),Letm1(IBA(65.70%,P<0.001),ET(70.13%,P<0.001))蛋白表达均出现不同程度的升高。(5)半腱肌m RNA相对表达量:与SA组相比,冬眠阵三组MCU(IBA(67.49%,P<0.001),ET(79.25%,P<0.001),LT(73.18%,P<0.001)),MICU1(IBA(56.63%,P<0.01),ET(66.80%,P<0.001),LT(33.20%,P<0.01)),Letm1(IBA(76.92%,P<0.001),ET(81.62%,P<0.001),LT(60.25%,P<0.001))m RNA表达均出现不同程度的降低。出眠组MCU、MICU1、MICU2 m RNA表达均恢复至夏季水平,Letm1相比于夏季组m RNA表达下降41.03%(P<0.001)。(6)半腱肌蛋白表达水平:与SA组相比,MCU蛋白表达在各个时期没有发生显著变化,MICU1蛋白表达在POST组升高了14.27%(P<0.05),Letm1在ET(32.47%,P<0.05),LT(47.69%,P<0.01),POST(44.06%,P<0.01)时期蛋白表达均不同程度升高。与IBA相比,MCU蛋白表达在ET和LT组分别升高了22.23%(P<0.05),23.52%(P<0.05)。研究结论:1.跖肌在冬眠期间未出现线粒体钙超载,腓肠肌和半腱肌在冬眠期间出现线粒体钙超载,但出眠时恢复夏季组水平,说明三种骨骼肌有良好的线粒体钙稳态,且跖肌的钙稳态维持能力强于腓肠肌和半腱肌。2.黄鼠腓肠肌在冬眠期排钙蛋白Letm1的蛋白低表达可能是线粒体钙浓度增加的原因之一;跖肌在冬眠阵期间摄钙蛋白和排钙蛋白的一致性表达,可能是维持线粒体钙稳态的机制;半腱肌在冬眠期摄钙蛋白MCU的高表达可能是线粒体钙水平增加的原因之一。

温度对中华鳖骨骼肌萎缩的影响及适应性分析

这是一篇关于中华鳖,骨骼肌,适应性,转录组,蛋白质组的论文, 主要内容为长时间卧床休息、太空飞行或类似情况下的肌肉活动减少会导致废用性萎缩,给人们的生活带来了极大的困扰,因此全面了解废用性肌萎缩的分子机制变得非常重要。冬眠动物例如灰熊(Ursus arctos horribilis)和达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)是一种研究肌萎缩的天然模型,在经历了冬季食物匮乏和低温的情况后未出现明显的废用性肌萎缩。作为变温动物的中华鳖(Pelodiscus sinensis),当水温降低时具有冬眠行为,我们初步观察到其在经过漫长的冬眠期后没有出现明显的废用性肌萎缩。为验证是否存在该现象,本研究通过观察形态学变化、测定关键的肌萎缩因子对我们的设想进行证实,并通过多组学联用的方式分析其适应性机理,最后再验证基于组学得到的部分与肌萎缩相关的mRNA和miRNA是否发挥作用。研究结果对进一步深入了解相关机制以及对人类预防骨骼肌萎缩具有较为重要的借鉴意义。主要研究结果如下。(1)中华鳖冬眠期间两种肌肉组织不萎缩的判定研究测定了中华鳖冬眠前对照组(Pre-H组)、冬眠1个月组(H1组)、冬眠2个月组(H2组)以及冬眠后组(Post-H组)的体重和肌重(胸肌和上乌喙骨肌)。结果显示各组体重下降并且都具有显著性,其中H1组降低5%(P<0.01),H2组降低9%(P<0.001),Post-H组降低15%(P<0.001)。两种肌肉湿重在冬眠期下降,与Pre-H组相比,Post-H组胸肌显著降低9%(P<0.05),上乌喙骨肌显著降低9%(P<0.05)。但肌肉湿重下降幅度小于体重,使得肌重与体重比稳步增加。此外我们发现与Pre-H组相比,各组的肌纤维面积略有降低但未显示显著差异。在肌亚纤维结构方面,与Pre-H组一样,H1组、H2组和Post-H组的胸肌和上乌喙骨肌肌丝未发生明显扭曲、断裂和溶解。最后对两种肌萎缩因子Mu RF1和MAFbx进行转录和翻译水平上的检测,结果显示,与Pre-H组相比,Mu RF1基因表达量除在上乌喙骨肌H1组显著上升外(P<0.05)其余各组显著下降(P<0.05),MAFbx基因表达量在胸肌的Post-H组和上乌喙骨肌的H2组显著下降(P<0.05)。与Pre-H组相比,Mu RF1蛋白表达量在胸肌H2组及上乌喙骨肌的H1组和Post-H组显著下降(P<0.05),MAFbx蛋白表达量除在胸肌H1组无变化外,在其余各组显著下调(P<0.05)。因此基于以上结果我们初步判定中华鳖的这两种肌肉在冬眠期间并没有出现明显的肌萎缩现象。(2)中华鳖胸肌适应性机制的初步探究为进一步了解中华鳖抵抗废用性肌萎缩的机制,本研究将冬眠前组的中华鳖胸肌作为对照组,冬眠2个组的中华鳖胸肌作为实验组,利用转录组学和蛋白质组学技术进行测序分析,筛选关键miRNA、mRNA、蛋白及重要通路。miRNA测序结果共注释到11个差异miRNA且都为上调。与肌肉萎缩相关的miRNA为dme-miR-7-5p、gga-miR-7、ggc-miR-7、pma-miR-30c-5p、ccrmiR-27d和dre-miR-27d。GO功能富集分析发现,在分子功能、细胞组分和生物过程上富集最显著的分别是GO:0005622(细胞内)、GO:0004143(二酰基甘油激酶活性)和GO:0042221(化学反应)。KEGG结果显示富集最为显著的前三条通路为pss03022(基础转录因子)、pss03010(核糖体)和pss00590(花生四烯酸代谢)。mRNA组学测序共筛选到差异基因(DEGs)4148个,其中上调基因2017个,下调基因2131个。其中蛋白代谢相关的基因如CAPN1显著下调,蛋白合成相关的基因如PIK3C3显著上调,自噬相关基因如ATG2A显著上升,骨骼肌生长分化相关的基因如MSTN显著下降,氧化防御相关的基因显著上升如GPX4。根据GSEA富集分析,筛选出一个可能在冬眠状态下发挥抵抗肌萎缩作用的基因集:CELL CYCLE(PSS04110)。KEGG富集到大量显著下调的与代谢相关的通路如pss01200(碳代谢)和pss00010(糖酵解/糖异生)。蛋白质组学共注释到1660个共表达蛋白,其中显著差异蛋白191个,上调蛋白47个,下调蛋白144个,且下调蛋白大部分和代谢相关如CS、IDH3A、ACO2等。GO富集到下调的代谢相关过程例如GO:0044710(单一有机体代谢过程)、GO:0008152(代谢过程)等;KEGG富集到下调的通路也大部分和代谢相关例如map01200(碳代谢)和map01100(代谢途径)。miRNA-mRNA联合分析发现,共注释到6个miRNA与mRNA数据有关联性,其中有4个miRNA的靶基因在转录组中对应下调。候选靶基因GO富集到下调的单体代谢过程(GO:0044710);候选靶基因KEGG富集分析显示:在TOP20的条目中有12条与代谢相关的信号通路,如Valine,leucine and isoleucine degradation和Metabolic pathways等。mRNA-蛋白质组联合分析发现,共关联到55个mRNA-蛋白质。大部分关联到的基因-蛋白表达趋势相同,在冬眠期间都是下调,而这些下调的基因-蛋白又大部分和代谢相关。显著差异基因-蛋白GO富集到下调的单一生物代谢过程和代谢过程;KEGG富集到map01100(代谢途径)和map01200(碳代谢)。(3)部分肌萎缩相关的mRNA、miRNA、酶和激素检测对中华鳖Pre-H组、H1组、H2组及Post-H组的胸肌、上乌喙骨肌和血清进行mRNA、miRNA、酶和激素检测。结果显示:与Pre-H组相比,肌肉发育相关基因MSTN的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的H1组和H2组显著下调,(P<0.05);MYOG基因的表达量在胸肌的三个组极显著上调(P<0.01)。与PreH组相比,能量代谢相关基因ACO2和IDH3A的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的Post-H组无显著变化,在其余各组显著下调(P<0.05)。与Pre-H组相比,氧化防御相关基因NFKBIE的表达量只在胸肌的H2组极显著上调(P<0.01),GPX4的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的三个组都出现了极显著上调(P<0.01);dme-miR-7-5p和pma-miR-30c-5p的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的三个组显著上调(P<0.05)。与Pre-H组相比,蛋白代谢相关基因CAPN1和CAPN3的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的三个组极显著下调(P<0.01);酶活检测方面,糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性在胸肌和上乌喙骨肌的三个组显著下调(P<0.05);激素含量上,与Pre-H组相比,血清中一氧化氮合酶的含量在三个组基本保持不变;血清中皮质醇的含量在三个组都出现了极显著下调(P<0.01)。综上所述,本文通过观察肌重、肌纤维的变化及测定关键肌萎缩因子的表达量初步判定中华鳖冬眠后骨骼肌没有出现肌萎缩。随后通过多组学分析初步发现中华鳖存在多种适应性策略,包括调节肌细胞的发育和分化和提高氧化防御能力等。最后通过检测部分组学中筛选出的mRNA和miRNA,以及一些相关的酶活和激素进一步证实了中华鳖在冬眠期间可以通过保持肌肉发育能力、提高氧化防御能力、降低蛋白质分解和抑制代谢这几种方式来维持骨骼肌结构和功能的完整。

温度对中华鳖骨骼肌萎缩的影响及适应性分析

这是一篇关于中华鳖,骨骼肌,适应性,转录组,蛋白质组的论文, 主要内容为长时间卧床休息、太空飞行或类似情况下的肌肉活动减少会导致废用性萎缩,给人们的生活带来了极大的困扰,因此全面了解废用性肌萎缩的分子机制变得非常重要。冬眠动物例如灰熊(Ursus arctos horribilis)和达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)是一种研究肌萎缩的天然模型,在经历了冬季食物匮乏和低温的情况后未出现明显的废用性肌萎缩。作为变温动物的中华鳖(Pelodiscus sinensis),当水温降低时具有冬眠行为,我们初步观察到其在经过漫长的冬眠期后没有出现明显的废用性肌萎缩。为验证是否存在该现象,本研究通过观察形态学变化、测定关键的肌萎缩因子对我们的设想进行证实,并通过多组学联用的方式分析其适应性机理,最后再验证基于组学得到的部分与肌萎缩相关的mRNA和miRNA是否发挥作用。研究结果对进一步深入了解相关机制以及对人类预防骨骼肌萎缩具有较为重要的借鉴意义。主要研究结果如下。(1)中华鳖冬眠期间两种肌肉组织不萎缩的判定研究测定了中华鳖冬眠前对照组(Pre-H组)、冬眠1个月组(H1组)、冬眠2个月组(H2组)以及冬眠后组(Post-H组)的体重和肌重(胸肌和上乌喙骨肌)。结果显示各组体重下降并且都具有显著性,其中H1组降低5%(P<0.01),H2组降低9%(P<0.001),Post-H组降低15%(P<0.001)。两种肌肉湿重在冬眠期下降,与Pre-H组相比,Post-H组胸肌显著降低9%(P<0.05),上乌喙骨肌显著降低9%(P<0.05)。但肌肉湿重下降幅度小于体重,使得肌重与体重比稳步增加。此外我们发现与Pre-H组相比,各组的肌纤维面积略有降低但未显示显著差异。在肌亚纤维结构方面,与Pre-H组一样,H1组、H2组和Post-H组的胸肌和上乌喙骨肌肌丝未发生明显扭曲、断裂和溶解。最后对两种肌萎缩因子Mu RF1和MAFbx进行转录和翻译水平上的检测,结果显示,与Pre-H组相比,Mu RF1基因表达量除在上乌喙骨肌H1组显著上升外(P<0.05)其余各组显著下降(P<0.05),MAFbx基因表达量在胸肌的Post-H组和上乌喙骨肌的H2组显著下降(P<0.05)。与Pre-H组相比,Mu RF1蛋白表达量在胸肌H2组及上乌喙骨肌的H1组和Post-H组显著下降(P<0.05),MAFbx蛋白表达量除在胸肌H1组无变化外,在其余各组显著下调(P<0.05)。因此基于以上结果我们初步判定中华鳖的这两种肌肉在冬眠期间并没有出现明显的肌萎缩现象。(2)中华鳖胸肌适应性机制的初步探究为进一步了解中华鳖抵抗废用性肌萎缩的机制,本研究将冬眠前组的中华鳖胸肌作为对照组,冬眠2个组的中华鳖胸肌作为实验组,利用转录组学和蛋白质组学技术进行测序分析,筛选关键miRNA、mRNA、蛋白及重要通路。miRNA测序结果共注释到11个差异miRNA且都为上调。与肌肉萎缩相关的miRNA为dme-miR-7-5p、gga-miR-7、ggc-miR-7、pma-miR-30c-5p、ccrmiR-27d和dre-miR-27d。GO功能富集分析发现,在分子功能、细胞组分和生物过程上富集最显著的分别是GO:0005622(细胞内)、GO:0004143(二酰基甘油激酶活性)和GO:0042221(化学反应)。KEGG结果显示富集最为显著的前三条通路为pss03022(基础转录因子)、pss03010(核糖体)和pss00590(花生四烯酸代谢)。mRNA组学测序共筛选到差异基因(DEGs)4148个,其中上调基因2017个,下调基因2131个。其中蛋白代谢相关的基因如CAPN1显著下调,蛋白合成相关的基因如PIK3C3显著上调,自噬相关基因如ATG2A显著上升,骨骼肌生长分化相关的基因如MSTN显著下降,氧化防御相关的基因显著上升如GPX4。根据GSEA富集分析,筛选出一个可能在冬眠状态下发挥抵抗肌萎缩作用的基因集:CELL CYCLE(PSS04110)。KEGG富集到大量显著下调的与代谢相关的通路如pss01200(碳代谢)和pss00010(糖酵解/糖异生)。蛋白质组学共注释到1660个共表达蛋白,其中显著差异蛋白191个,上调蛋白47个,下调蛋白144个,且下调蛋白大部分和代谢相关如CS、IDH3A、ACO2等。GO富集到下调的代谢相关过程例如GO:0044710(单一有机体代谢过程)、GO:0008152(代谢过程)等;KEGG富集到下调的通路也大部分和代谢相关例如map01200(碳代谢)和map01100(代谢途径)。miRNA-mRNA联合分析发现,共注释到6个miRNA与mRNA数据有关联性,其中有4个miRNA的靶基因在转录组中对应下调。候选靶基因GO富集到下调的单体代谢过程(GO:0044710);候选靶基因KEGG富集分析显示:在TOP20的条目中有12条与代谢相关的信号通路,如Valine,leucine and isoleucine degradation和Metabolic pathways等。mRNA-蛋白质组联合分析发现,共关联到55个mRNA-蛋白质。大部分关联到的基因-蛋白表达趋势相同,在冬眠期间都是下调,而这些下调的基因-蛋白又大部分和代谢相关。显著差异基因-蛋白GO富集到下调的单一生物代谢过程和代谢过程;KEGG富集到map01100(代谢途径)和map01200(碳代谢)。(3)部分肌萎缩相关的mRNA、miRNA、酶和激素检测对中华鳖Pre-H组、H1组、H2组及Post-H组的胸肌、上乌喙骨肌和血清进行mRNA、miRNA、酶和激素检测。结果显示:与Pre-H组相比,肌肉发育相关基因MSTN的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的H1组和H2组显著下调,(P<0.05);MYOG基因的表达量在胸肌的三个组极显著上调(P<0.01)。与PreH组相比,能量代谢相关基因ACO2和IDH3A的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的Post-H组无显著变化,在其余各组显著下调(P<0.05)。与Pre-H组相比,氧化防御相关基因NFKBIE的表达量只在胸肌的H2组极显著上调(P<0.01),GPX4的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的三个组都出现了极显著上调(P<0.01);dme-miR-7-5p和pma-miR-30c-5p的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的三个组显著上调(P<0.05)。与Pre-H组相比,蛋白代谢相关基因CAPN1和CAPN3的表达量在胸肌和上乌喙骨肌的三个组极显著下调(P<0.01);酶活检测方面,糜蛋白酶和胰蛋白酶的活性在胸肌和上乌喙骨肌的三个组显著下调(P<0.05);激素含量上,与Pre-H组相比,血清中一氧化氮合酶的含量在三个组基本保持不变;血清中皮质醇的含量在三个组都出现了极显著下调(P<0.01)。综上所述,本文通过观察肌重、肌纤维的变化及测定关键肌萎缩因子的表达量初步判定中华鳖冬眠后骨骼肌没有出现肌萎缩。随后通过多组学分析初步发现中华鳖存在多种适应性策略,包括调节肌细胞的发育和分化和提高氧化防御能力等。最后通过检测部分组学中筛选出的mRNA和miRNA,以及一些相关的酶活和激素进一步证实了中华鳖在冬眠期间可以通过保持肌肉发育能力、提高氧化防御能力、降低蛋白质分解和抑制代谢这几种方式来维持骨骼肌结构和功能的完整。

冬眠达乌尔黄鼠骨骼肌中自噬水平的变化与调控机制的研究

这是一篇关于冬眠,骨骼肌,自噬,LC3,Beclin1的论文, 主要内容为研究背景及目的:肌细胞内蛋白合成速率超过蛋白降解速率时,肌肉会生长;蛋白降解速率超过蛋白合成速率时,肌肉会萎缩。在正常状态下,自噬的主要功能是降解细胞内衰老与受损的细胞器,实现细胞内细胞器的更新;在不利状态下,自噬会降解细胞内非必须蛋白质等大分子物质,为细胞生存提供能量与合成底物,是一种舍车保帅的自救机制。因此自噬是一种生物存活的基础机制,所以在进化过程中,所有真核生物都存在此机制。哺乳动物主要存在两条调控自噬的信号通路,TOR通路与Beclin1通路。在正常的条件下,TOR通路的效应蛋白m TOR活性化后,会抑制自噬的启动。Beclin1通路中Beclin1-Vps34复合物是控制自噬的起始步骤之一,在饥饿和缺氧等应激条件下,Beclin1-Vps34复合物会诱导自噬的启动。自噬启动后,LC3蛋白是促使自噬顺利进行的关键步骤,其作用是促使自噬囊泡成熟。自噬与废用性肌萎缩的关系是当今研究的热点问题之一,目前已有许多研究对此从不同角度进行了研究。研究结果显示,在肌肉萎缩状态下抑制自噬,肌肉状态得到了部分缓解,表明过度激活的自噬会导致肌肉萎缩;在非冬眠动物骨骼肌中抑制自噬,导致骨骼肌形态与功能无法正常维持,表明骨骼肌结构与功能的维持需要适量自噬。冬眠是许多动物为抵抗恶劣坏境的一种策略,在经历长时间的冬眠期不活动后,动物的骨骼肌质量丢失较少,结构和功能维持较完整。因此,为了探究自噬是否参与了冬眠动物冬眠期间骨骼肌的适应和维持。本研究以达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)为研究对象,对冬眠不同时期不同类型骨骼肌中自噬水平的标志性指标,及其信号通路中的关键性指标进行了检测。实验方法:将40只达乌尔黄鼠分为五组,每组8只,分别是夏季活跃组(summer active group,SA)、冬眠前组(pre-hibernation group,PRE)、冬眠中组(hibernation group,HIB)、阵间觉醒组(interbout arousal group,IBA)及出眠组(post-hibernation,POST)。(1)记录达乌尔黄鼠体重、肌重并使用冰冻切片与免疫荧光组织化学技术检测比目鱼肌与趾长伸肌的纤维横截面积作为达乌尔黄鼠骨骼肌状态的基础数据。(2)使用透视电子显微镜观察自噬囊泡的形态确定自噬是否发生。(3)使用实时荧光定量PCR技术检测Mu RF-1、Atrogin-1、m TOR、Raptor、AKT、Beclin1、LC3、P62转录水平的变化。(4)使用蛋白免疫印迹的方法检测Mu RF-1、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、m TOR、Raptor、P-m TOR,Beclin1、Cathepsin L、Atg7、LC3、P62的蛋白表达水平。(5)使用免疫荧光组织化学技术检测LC3、P62的蛋白聚点变化。结果与讨论:1)冬眠不同时期达乌尔黄鼠体重、肌重和肌纤维横截面积的变化与夏季组相比,冬眠前组达乌尔黄鼠体重显著升高(P<0.05),这可能是由于冬眠前育肥导致的机体脂肪增加所致;与冬眠前组相比,冬眠中组、阵间觉醒组和出眠组体重均显著减少(P<0.05)。与冬眠前组相比,比目鱼肌和趾长伸肌肌肉重量在整个冬眠时期没有显著变化(P>0.05)。与冬眠前组相比,冬眠中组、阵间觉醒组和出眠组的达乌尔黄鼠比目鱼肌和趾长伸肌的肌纤维横截面积也没有显著变化(P>0.05)。这些结果显示,达乌尔黄鼠虽然经历了长期的冬眠不活动状态,但比目鱼肌和趾长伸肌并没有出现显著萎缩。2)自噬囊泡的检测电镜是观察自噬是否存在也是检测自噬是否发生的金标准,在冬眠中组两种肌肉中,均发现了自噬囊泡、肌丝散乱、线粒体膨大等现象;而在阵间觉醒组的肌肉中并未检测到明显的自噬囊泡。这些结果显示,在冬眠中有自噬现象的发生,阵间觉醒对降低自噬水平可能有一定作用。3)Beclin1信号通路的变化LC3是促使自噬囊泡成熟的关键蛋白,LC3蛋白表达增加代表自噬水平升高。蛋白印迹结果显示,与冬眠前组相比,冬眠中组比目鱼肌LC3蛋白表达水平升高了60%(P<0.05),阵间觉醒组则没有显著变化(P>0.05);LC3聚点数量的多少,可以代表LC3的表达水平,其也可以反映自噬水平变化,使用免疫荧光技术检测了LC3聚点。与冬眠前组相比,冬眠中组比目鱼肌LC3聚点数量显著升高68%(P<0.05),阵间觉醒组则没有显著差异(P>0.05)。趾长伸肌的蛋白印迹结果显示,相比于冬眠前组,冬眠中组和阵间觉醒组的LC3蛋白水平分别降低了61%和84%(P<0.05),LC3聚点数量结果显示,与冬眠前组相比,冬眠中组和阵间觉醒组分别降低了33%和54%(P<0.05)。这表明在比目鱼肌中自噬水平在冬眠中组升高,阵间觉醒组降低;趾长伸肌中冬眠中组和阵间觉醒组的自噬水平都是处于一种低表达状态。Beclin1是Beclin1通路的关键蛋白,它也是构成自噬的基础物质之一,在不利条件下,Beclin1会诱导自噬启动,其表达水平与自噬水平呈正比。蛋白免疫印迹结果显示,与冬眠前组相比,冬眠中组比目鱼肌Beclin1蛋白水平升高18%(P<0.05),阵间觉醒组降低了45%(P<0.05);趾长伸肌蛋白印迹结果显示,与冬眠前组相比,冬眠中组和阵间觉醒组分别下降了32.5%和19.5%(P<0.05)。这表明自噬水平上升时,Beclin1蛋白的表达水平也上升,自噬水平下降时,Beclin1蛋白表达水平也下降,由于Beclin1在两组肌肉中的的变化趋势与自噬水平的变化趋势相一致,因此这一结果提示Beclin1通路是冬眠时调控骨骼肌中自噬水平的主要调控通路。4)TOR信号通路的变化TOR通路的关键蛋白是m TOR,其磷酸化后被激活,可以抑制自噬的发生,其表达水平和自噬水平呈反比。比目鱼肌和趾长伸肌的结果显示,与冬眠前组相比,其冬眠中组与阵间觉醒组phospho-m TOR的表达水平均显著降低的。由于比目鱼肌自噬水平在冬眠中组上调,阵间觉醒组下调;趾长伸肌的自噬水平在冬眠中组和阵间觉醒组都是下降的。由以上结果我们可以得出冬眠时TOR通路的变化与自噬水平的变化并不一致,提示冬眠时TOR通路并未参与自噬的调控,可能存在其它通路对自噬进行调控。结论:冬眠中组比目鱼肌LC3免疫荧光结果与免疫印迹结果均显示,其蛋白表达水平冬眠中组增加,阵间觉醒减少,这一结果表明冬眠中组比目鱼肌自噬水平上升,阵间觉醒组比目鱼肌自噬水平下降。在趾长伸肌中,冬眠中组与阵间觉醒组免疫荧光与免疫印迹结果均显示,LC3蛋白表达水平下降,这一结果显示,趾长伸肌冬眠中组和阵间觉醒组的自噬水平都是下降的。冬眠时,促进自噬发生的通路,其关键蛋白Beclin1,蛋白表达水平与两组肌肉中自噬水平的变化相一致,提示Beclin1通路是冬眠时,调控自噬的主要通路。抑制自噬发生的通路,其关键蛋白phospho-m TOR,在冬眠时蛋白表达水平均在两组肌肉中是下调的,其变化趋势与自噬水平变化不一致,提示TOR通路在冬眠时,可能不参与对冬眠时骨骼肌中自噬的调控,可能存在其它通路对自噬进行调控。