冷鲜牛肉中假单胞菌和热死环丝菌致腐机制及其光动力杀菌控制研究

这是一篇关于腐败机制,假单胞菌,热死环丝菌,代谢组学,光动力杀菌的论文, 主要内容为冷鲜牛肉是中国居民最常消费的鲜肉之一,牛肉不仅肉质鲜美,还具有高蛋白、低脂肪的优点。然而,冷鲜牛肉在冷链加工和运输中极易受到微生物污染,假单胞菌、热死环丝菌等耐冷菌是引起牛肉组织结构松散和不良气味的优势腐败菌。光动力杀菌是一种无毒低能耗的杀菌技术,具备良好的杀菌效果。为揭示冷鲜牛肉微生物结构演替规律,探究牛肉优势菌假单胞菌和热死环丝菌的致腐互作,研究分析三种不同销售途径的冷鲜牛肉在4℃贮藏期间的菌群结构变化,评价鉴定的优势腐败菌假单胞菌和热死环丝菌致腐能力,比较基因组学分析强弱腐败株的基因结构差异,基于理化指标和HPLC-MS/MS代谢组阐明牛肉糜中假单胞菌和热丝环丝菌单/共接种的致腐特性,并采用光动力杀菌技术进一步评价光动力结合不同包装方式对牛肉糜在冷藏期间品质改善的影响。研究为揭示冷鲜牛肉微生物致腐机制,提高肉品冷链的贮藏品质及型保鲜技术的研发提供新的理论基础。主要结果如下:采用非依赖培养和依赖培养的16S rDNA高通量测序分析菜市场、超市和电商三种销售途径的冷鲜牛肉中微生物群落结构及其演替规律。结果显示,三种销售途径的牛肉微生物菌群种类和丰度大小存在较大差异。菜场牛肉初期微生物种类较多,且各菌属的丰度差异不大,在中后期主要以假单胞菌属、环丝菌属和不动杆菌属为主。超市牛肉的微生物多样性较低,主要以不动杆菌属、发光杆菌属、假单胞菌属、类香味菌属为主;电商平台牛肉微生物多样性最高,在贮藏中后期主要以假单胞菌属、环丝菌属和沙雷氏菌属为主。非依赖培养高通量测序分析菌群种类略多于依赖培养,其中主要的优势菌基本相似,部分细菌种属的丰度发生较大变化,尤其是类香味菌属和沙雷氏菌属,在依赖培养中其丰度远高于非依赖培养。采用HS-SPME-GC-MS分析在牛肉冷藏期间共检测到30种挥发性成分,其中3-甲基-1-丁醇和乙偶姻含量与假单胞菌属和环丝菌属呈正相关。通过4℃牛肉汁中TVB-N、蛋白酶活力和乙偶姻指标评价分离菌株的致腐能力,并比较强弱腐败株的全基因组序列。热死环丝菌BT27(强致腐株)和BT25(弱致腐株)的比较基因组学发现菌株腐败能力的强弱与编码碳水化合物代谢基因数量有关。假单胞菌PF83(强致腐株)和PF57(弱致腐株)的比较基因组学分析显示,两株强弱菌株的编码基因主要涉及氨基酸转运代谢,其腐败潜力与蛋白降解和氨基酸利用有关。鉴于隆德假单胞菌比莓实假单胞菌有更强的致腐性,研究以隆德假单胞菌和热死环丝菌为研究对象,分析两种腐败菌单/共接种于牛肉糜中的腐败特征。通过理化指标评估不同单接种组的腐败特征发现,热死环丝菌能够大量分解糖类产生乙偶姻;隆德假单胞菌能够分解蛋白产生可溶性多肽和TVB-N。在共接种组中,两种菌的腐败特性均受到影响,互相存在竞争作用。HPLC-MS/MS代谢物分析发现热死环丝菌主要通过糖代谢、核酸代谢引起牛肉腐败,隆德假单胞菌主要通过氨基酸代谢导致牛肉腐败。在共接种组中共筛选到409个差异代谢物,4条显著代谢通路,并发现产生新的代谢物。此外,8种关键代谢物肌酸、肌苷、肌苷酸、尿嘧啶、丙氨酸、谷氨酰胺、3-甲基组氨酸和3-羟基癸酸被确定为潜在的腐败标志物。通过分析贮藏间理化指标变化来探究姜黄素介导的光动力杀菌对牛肉微生物和冷藏品质的影响。采用姜黄素浓度单因素实验发现60 μM姜黄素浓度、0.5 mg/mL柠檬酸、光照30 min处理为最佳杀菌条件。将该光动力杀菌条件结合不同包装应用于牛肉糜的品质控制。结果显示,光动力处理组普通包装和真空包装菌落总数在整个贮藏期间始终低于对照组;在贮藏末期光动力处理组可溶性多肽显著低于对照组;其TVB-N的变化趋势与可溶性多肽类似,经处理后牛肉的pH值及ΔE值的上升速度变慢。结果表明,光动力处理抑制微生物的生长从而延缓牛肉蛋白质的降解,达到对牛肉的保鲜效果。综上,冷鲜牛肉的微生物群落结构及其演替规律与其销售途径有关,牛肉在4℃冷藏期间优势腐败菌包括假单胞菌属、不动杆菌属、发光杆菌属、环丝菌属、沙雷氏菌属、类香味菌属。假单胞菌和热死环丝菌强弱腐败株差异与其参与代谢功能的编码基因数量有关。热死环丝菌以碳水化合物代谢形成乙偶姻,隆德假单胞菌主要以氨基酸代谢为主,两者在共接种体系中形成更多的腐败代谢产物,并表现竞争性作用,其中组氨酸代谢参与两种优势菌致腐代谢。姜黄素介导的光动力对两种优势菌表现良好的杀菌效果,结合不同包装方式能有效降低牛肉中假单胞菌和热死环丝菌生长,延缓蛋白质降解和色泽变化,对牛肉具有良好的保鲜作用。

基于多组学探析二至丸干预自然衰老模型大鼠的作用机制研究

这是一篇关于自然衰老模型,二至丸,延缓衰老,肠道菌群,转录组学,代谢组学,代谢通路,作用机制的论文, 主要内容为目的:本实验以自然衰老模型大鼠为研究对象,系统评估不同剂量二至丸(Erzhi Pill,EZP)的延缓衰老作用,从“微生物-基因-分子”多组学角度阐释二至丸延缓衰老的生物学基础与作用机制,为二至丸的临床使用及开发提供理论依据。方法:1.二至丸对自然衰老模型大鼠的延缓衰老作用评价建立50只自然衰老大鼠模型,随机分为5组,分别为衰老模型组(K,n=10),二至丸低(EL,n=11)、中(EM,n=10)、高(EH,n=11)剂量组和金匮肾气丸组(J,n=8)。SD大鼠饲养至21月龄时给予药物干预,衰老模型组给予普通饲料喂养,二至丸低、中、高剂量组大鼠分别给予4%、8%、16%二至丸含药饲料,金匮肾气丸组(JSP)大鼠给予4.4%的金匮肾气丸含药饲料,每只20 g×d-1,连续喂养90 d。另取6月龄SD大鼠作为青年对照组(Q,n=8),6周龄SD大鼠为幼年对照组(Y,n=10),给予普通饲料。通过观察二至丸对自然衰老模型大鼠的一般体征、体成分的变化、抗氧化指标和端粒长度等影响,初步评价二至丸对自然衰老模型大鼠的延缓衰老作用。2.二至丸对自然衰老模型大鼠肠道菌群的影响对大鼠盲肠内容物进行16S r RNA V3-V4区序列检测,通过结果解析自然衰老模型大鼠的肠道菌群多样性,进一步观察在门和属分类水平上差异菌的相对丰度变化,采用功能预测分析和网络分析对差异菌属的功能和相互作用进行深入探析。3.基于肝脏转录组学研究二至丸延缓衰老的作用机制采用RNA-seq测序技术进行转录组分析,首先提取大鼠肝组织的总RNA进行质检,用于创建RNA文库后进行上机检测。利用序列数据的表达量筛选出各组之间的差异表达基因(筛选条件为P-value<0.05且|log2FC|≥1),并对其进行基因本体论注释分析和KEGG通路富集分析,深入探析二至丸延缓衰老的差异表达基因与生物功能通路。为验证RNA测序数据与真实情况的相近程度,根据基因的表达量及其功能通路选取部分差异基因进行q RT-PCR验证。4.基于血浆代谢组学研究二至丸延缓衰老的作用机制利用UPLC-QTOF-MS/MS对自然衰老模型大鼠的血浆样品进行代谢组学分析,通过非监督主成分分析和正交偏最小二乘判别分析筛选数据,将VIP大于1且P<0.05的物质定义为差异代谢物,结合KEGG代谢通路分析。进一步联合多组学分析筛选出关键通路,从物质代谢角度探析二至丸延缓衰老作用机制。结果:1.二至丸对自然衰老模型大鼠的延缓衰老的作用评价(1)一般体征观察:观察发现,与Q、Y组相比,K组出现了体重下降、自主活动明显减少、精神萎靡、背部皮肤松弛、背毛卷曲枯黄无光泽、脱毛加速等明显的衰老症状。药物干预后,与K组比较,各给药组大鼠衰老症状均有不同程度地缓解,初步表明EZP具有一定程度的延缓衰老的作用。(2)衰老大鼠的体质量变化:结果表明各组大鼠体质量组间无统计学意义(P>0.05),说明在本实验中EZP对自然衰老模型大鼠的体质量未造成明显影响。但K组大鼠的体质量随着年龄增长而减小,而EZP各给药组的体质量均有一定程度的回升趋势。(3)Kaplan-Meier生存曲线:结果表明,长达90天的EZP干预可以使自然衰老模型大鼠的存活率呈增加趋势,但无显著性差异。(4)体成分分析:利用生物阻抗频谱进行体成分检测发现,随着大鼠年龄增长,大鼠的TBW呈现下降趋势,ECF占比呈上升趋势,ICF占比随之出现下降趋势,且呈现FM占比上升而FFM占比下降的趋势。与Y比较,EH组的TBW和FFW明显下降,FM增加(P<0.05);与K比较,各组无统计学意义。(5)脏器指数结果:与Y组大鼠的胸腺和脾脏指数比较,Q、K、EL、EM、EH和J组的胸腺和脾脏指数均极显著下降(P<0.001)。与K组比较,各不同给药浓度的EZP对自然衰老模型大鼠的胸腺和脾脏指数均有上升的趋势且呈现剂量依赖性,但无统计学差异。采用非参数检验,与Y组肝脏指数比较,Q、K、EL、EH、J组肝脏指数显著下降(调整后P<0.05),其它组之间的差异无统计学意义。与K组的肝脏指数相比,各组间未见显著性差异。与Y组肾脏指数比较,K、EL、EH和J组的肾脏指数显著降低(调整后P<0.05)。EZP低、中、高剂量组和J组的肾脏指数与老年模型组相比无显著性差异。(6)肝肾组织HE染色结果:与Y组和Q组相比,K组大鼠的肾小球体积略小,肾小囊囊腔明显增大,肾小管管腔扩张伴上皮细胞空泡变性、坏死脱落。EL、EM组部分肾小管肿胀,且伴随上皮细胞损伤脱落,EH组少量肾小管上皮细胞损伤。J组部分细胞排列疏松,肾小管肿胀、扩张伴上皮细胞坏死脱落;各组大鼠肝脏组织HE染色结果未见明显的肝组织病理性变化。(7)血细胞检测结果:与K组对比各组白细胞数、红细胞数、血小板数、红细胞比容和血红蛋白水平均无显著差异(P>0.05)。(8)肝脏抗氧化指标检验:与Y组比较,K组大鼠丙二醛(MDA)含量极显著增加(P<0.001);与K组比较,EZP给药后能够使MDA的含量降低,特别是EH组能够显著下调自然衰老模型大鼠的MDA水平(P<0.05);同时,J组也能使老年大鼠的MDA水平下降,但差异未有明显的统计学意义。随着大鼠年龄增加,超氧化物歧化酶(SOD)活力水平有下降趋势,与K组相比,EZP各剂量组和J组SOD活力水平显现上升趋势,但未达到统计学差异。(9)肝脏端粒长度测定:随着年龄增长,衰老大鼠端粒长度逐渐下降,EZP给药后有回升的趋势,并呈现剂量依赖性。端粒长度的分布在EL组-Y组(调整后P=0.028)、EL组-Q组(调整后P=0.001)的差异有统计学意义,其它组之间的差异无统计学意义。2.二至丸对自然衰老模型大鼠肠道菌群的影响(1)Alpha多样性分析表明,除EM组和Y组微生物群落多样性显著高于K组外(P<0.05),其他各组样本的物种Shannon指数无显著差异;EM、EH和Y组的Simpson指数均高于K组(P<0.05);与K组比较,EM、EH、J、Q、Y组的Chao指数和Ace指数显著减低(P<0.05)。(2)在门水平上,各组大鼠肠道菌群以Firmicutes为主,其次是Bacteroidota和Actinobacteriota。(3)在属水平上,与K组比较,EL组和EH组的Romboutsia丰度显著下降(P<0.05),EM组虽然有下降趋势但差异不显著;EL组和EH组的norank＿f＿＿norank＿o＿＿Clostridia＿UCG-014丰度显著下降(P<0.05),EM组有下降趋势但无显著性差异;EL、EM和EH组的Clostridium＿sensu＿stricto＿1丰度均显著下降(P<0.05);EL、EM组的Allobaculum显著上升(P<0.05),EH组有上升趋势但差异不显著;EL、EM和EH组的UCG-005显著上升(P<0.05);EL、EM和EH组的norank＿f＿＿Eubacterium＿coprostanoligenes＿group显著上升(P<0.05)。(4)COG功能预测涉及碳水化合物、氨基酸及能量代谢,癌症,免疫疾病以及细胞生长和死亡等微生物基因,但主要集中于代谢相关的微生物基因。3.基于肝脏转录组学研究二至丸延缓衰老的作用机制本实验对68个肝脏样品进行转录组测序分析,测序得到531.31 Gb clean data,碱基质量值为30时,正确率在93.62%以上。差异表达基因结果表明,与K组比较,Y组共1687个差异表达基因(DEGs),其中上调DEGs1010个,下调677个;Q组总计590个DEGs,其中上调403个,下调187个;EL组共36个DEGs,其中上调30个、下调6个;EM组总计10个DEGs,上调5个,下调5个;EH组共242个DEGs,其中上调199个,下调43个;J组共34个DEGs,上调18个,下调16个。与K组比较,Y组在类固醇生物合成(Steroid biosynthesis)途径中富集程度最高;Q组在昼夜节律通路(Circadian rhythm)的富集程度最高;EL组在谷胱甘肽代谢(glutathione metabolic pathway)通路上的富集程度最高;EM、EH组在昼夜节律通路富集程度最高;J组初级胆汁酸的生物合成(primary bile acid biosynthesis)通路具有高富集率。q RT-PCR验证的差异基因的表达结果与转录组一致。4.基于血浆代谢组学研究二至丸延缓衰老的作用机制经代谢组学分析,获取幼年大鼠与老年大鼠血浆样本中的生物标志物45个,富集代谢通路11条;EZP高剂量干预自然衰老大鼠血浆样本的19个差异化合物富集得到9条生物通路;金匮肾气丸干预自然衰老大鼠后的25个差异化合物主要富集在7条生物通路。EZP和金匮肾气丸共同显著回调8个差异代谢物质:褪黑激素(Melatonin radical)、肌醇1,4,5—三磷酸(myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate)、廿四碳六烯酸(Tetracosahexaenoic acid)、乙酰磷酸(Acetylphosphate)、甘油二酸酯(DG(15:0/0:0/18:4n3))、尿胆素原(Urobilinogen)、溶血PC(Lyso PC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0:0))、中胆红素原(Mesobilirubinogen),共同参与丙酮酸代谢、卟啉和叶绿素代谢、磷酸肌醇代谢、甘油磷脂代谢、磷脂酰肌醇信号系统生物代谢通路。结论:1.EZP能够缓解自然衰老模型大鼠的衰老症状,提高存活率,并可能通过改善自然衰老模型大鼠免疫功能、抗氧化能力和端粒长度起到延缓衰老的作用且呈剂量依赖性,其中EZP高剂量作用效果较为明显。2.EZP可能改变自然衰老大鼠肠道菌群的结构组成和丰度比例发挥延缓衰老作用,其中高剂量调节肠道菌群延缓衰老效果最佳。3.EZP可能通过上调基因Nr1d1、Hsd17b2、Efna1、Xbp1,下调基因Cdkn1a、Gstt3、Insig1、Lpin1、Tsku、Dpt从而发挥延缓衰老作用,调节自然衰老模型大鼠的癌症通路、昼夜节律通路、PI3K-Akt信号转导等代谢相关通路发挥其延缓衰老的作用,JSP则可能通过初级胆汁酸的生物合成通路发挥延缓衰老作用。4.EZP可能通过作用于视黄醇代谢、丙酮酸代谢、半乳糖代谢、磷脂酰肌醇信号系统、磷酸肌醇代谢、卟啉和叶绿素代谢、甘油磷脂代谢、氨基糖和核苷酸糖等代谢通路发挥其延缓衰老作用,且滋阴方EZP和补阳方JSP可通过多途径调节衰老相关通路发挥延缓衰老作用。5.多组学的联合分析提示EZP给药后的自然衰老大鼠肠道微生物群与宿主代谢密切相关,组学联合的关键通路是昼夜节律通路、PI3K-Akt信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路。

花背蟾蜍（Strauchbufo raddei）的肠道微生物及其代谢物在冬眠过程中适应性变化的研究

这是一篇关于冬眠,花背蟾蜍,肠道微生物,代谢组学,组织学的论文, 主要内容为冬眠是一些脊椎动物在应对不利环境过程中长期进化形成的一种适应性生存策略。冬眠期间,脊椎动物将经历长期禁食过程,因此动物在冬眠期的能量来源将发生转变。肠道微生物参与了脊椎动物的多种代谢活动,并在生长发育、营养吸收和免疫调节等方面发挥着重要作用,但其在脊椎动物冬眠期间的功能仍然不明确。目前关于冬眠动物肠道微生物的研究主要集中于哺乳动物,两栖动物获得的关注较少。此外,冬眠对两栖动物肠道代谢组的影响还存在极大的研究空缺。本研究以花背蟾蜍(Strauchbufo raddei)作为研究对象,通过构建人工冬眠环境来模拟花背蟾蜍的冬眠状态,通过组织学和消化酶活力检测探究了冬眠对肠道微生物生存环境的影响,利用微生物组学和代谢组学探究了花背蟾蜍冬眠前后肠道微生物和代谢物的变化,并通过相关性分析揭示了肠道微生物在花背蟾蜍冬眠期代谢调节中的潜在功能。本论文的主要研究结果如下:(1)与活跃期相比,冬眠期花背蟾蜍的小肠结构发生明显改变,具体表现为十二指肠和回肠的肠绒毛发生萎缩,十二指肠的肠绒毛高度和肠上皮细胞高度显著下降;(2)冬眠期花背蟾蜍的小肠胰蛋白酶和脂肪酶活性显著低于活跃期;(3)冬眠期花背蟾蜍的肠道微生物的多样性显著降低,且肠道微生物结构发生变化,在活跃期厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度最高,而冬眠期变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度最高;(4)假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)和红球菌属(Rhodococcus)可以作为生物标志物来区分活跃期和冬眠期的肠道微生物;(5)冬眠期花背蟾蜍的肠道微生物对环境压力的抵抗力更强;(6)冬眠期花背蟾蜍的代谢水平被广泛抑制,差异代谢物显著富集在脂肪酸的生物合成途径,冬眠期显著富集的差异代谢物在能量代谢和免疫调节中具有潜在功能;(7)肠道微生物可能参与了花背蟾蜍冬眠过程的代谢调控。综上所述,本研究揭示了花背蟾蜍的肠道微生物及其代谢物对冬眠环境的积极响应和适应性变化,为我们更好地理解两栖动物的适应性进化和发育历程提供了更深入的见解,同时也加深了我们对脊椎动物在极端环境下不同生存策略的理解。

基于多组学探析二至丸干预自然衰老模型大鼠的作用机制研究

这是一篇关于自然衰老模型,二至丸,延缓衰老,肠道菌群,转录组学,代谢组学,代谢通路,作用机制的论文, 主要内容为目的:本实验以自然衰老模型大鼠为研究对象,系统评估不同剂量二至丸(Erzhi Pill,EZP)的延缓衰老作用,从“微生物-基因-分子”多组学角度阐释二至丸延缓衰老的生物学基础与作用机制,为二至丸的临床使用及开发提供理论依据。方法:1.二至丸对自然衰老模型大鼠的延缓衰老作用评价建立50只自然衰老大鼠模型,随机分为5组,分别为衰老模型组(K,n=10),二至丸低(EL,n=11)、中(EM,n=10)、高(EH,n=11)剂量组和金匮肾气丸组(J,n=8)。SD大鼠饲养至21月龄时给予药物干预,衰老模型组给予普通饲料喂养,二至丸低、中、高剂量组大鼠分别给予4%、8%、16%二至丸含药饲料,金匮肾气丸组(JSP)大鼠给予4.4%的金匮肾气丸含药饲料,每只20 g×d-1,连续喂养90 d。另取6月龄SD大鼠作为青年对照组(Q,n=8),6周龄SD大鼠为幼年对照组(Y,n=10),给予普通饲料。通过观察二至丸对自然衰老模型大鼠的一般体征、体成分的变化、抗氧化指标和端粒长度等影响,初步评价二至丸对自然衰老模型大鼠的延缓衰老作用。2.二至丸对自然衰老模型大鼠肠道菌群的影响对大鼠盲肠内容物进行16S r RNA V3-V4区序列检测,通过结果解析自然衰老模型大鼠的肠道菌群多样性,进一步观察在门和属分类水平上差异菌的相对丰度变化,采用功能预测分析和网络分析对差异菌属的功能和相互作用进行深入探析。3.基于肝脏转录组学研究二至丸延缓衰老的作用机制采用RNA-seq测序技术进行转录组分析,首先提取大鼠肝组织的总RNA进行质检,用于创建RNA文库后进行上机检测。利用序列数据的表达量筛选出各组之间的差异表达基因(筛选条件为P-value<0.05且|log2FC|≥1),并对其进行基因本体论注释分析和KEGG通路富集分析,深入探析二至丸延缓衰老的差异表达基因与生物功能通路。为验证RNA测序数据与真实情况的相近程度,根据基因的表达量及其功能通路选取部分差异基因进行q RT-PCR验证。4.基于血浆代谢组学研究二至丸延缓衰老的作用机制利用UPLC-QTOF-MS/MS对自然衰老模型大鼠的血浆样品进行代谢组学分析,通过非监督主成分分析和正交偏最小二乘判别分析筛选数据,将VIP大于1且P<0.05的物质定义为差异代谢物,结合KEGG代谢通路分析。进一步联合多组学分析筛选出关键通路,从物质代谢角度探析二至丸延缓衰老作用机制。结果:1.二至丸对自然衰老模型大鼠的延缓衰老的作用评价(1)一般体征观察:观察发现,与Q、Y组相比,K组出现了体重下降、自主活动明显减少、精神萎靡、背部皮肤松弛、背毛卷曲枯黄无光泽、脱毛加速等明显的衰老症状。药物干预后,与K组比较,各给药组大鼠衰老症状均有不同程度地缓解,初步表明EZP具有一定程度的延缓衰老的作用。(2)衰老大鼠的体质量变化:结果表明各组大鼠体质量组间无统计学意义(P>0.05),说明在本实验中EZP对自然衰老模型大鼠的体质量未造成明显影响。但K组大鼠的体质量随着年龄增长而减小,而EZP各给药组的体质量均有一定程度的回升趋势。(3)Kaplan-Meier生存曲线:结果表明,长达90天的EZP干预可以使自然衰老模型大鼠的存活率呈增加趋势,但无显著性差异。(4)体成分分析:利用生物阻抗频谱进行体成分检测发现,随着大鼠年龄增长,大鼠的TBW呈现下降趋势,ECF占比呈上升趋势,ICF占比随之出现下降趋势,且呈现FM占比上升而FFM占比下降的趋势。与Y比较,EH组的TBW和FFW明显下降,FM增加(P<0.05);与K比较,各组无统计学意义。(5)脏器指数结果:与Y组大鼠的胸腺和脾脏指数比较,Q、K、EL、EM、EH和J组的胸腺和脾脏指数均极显著下降(P<0.001)。与K组比较,各不同给药浓度的EZP对自然衰老模型大鼠的胸腺和脾脏指数均有上升的趋势且呈现剂量依赖性,但无统计学差异。采用非参数检验,与Y组肝脏指数比较,Q、K、EL、EH、J组肝脏指数显著下降(调整后P<0.05),其它组之间的差异无统计学意义。与K组的肝脏指数相比,各组间未见显著性差异。与Y组肾脏指数比较,K、EL、EH和J组的肾脏指数显著降低(调整后P<0.05)。EZP低、中、高剂量组和J组的肾脏指数与老年模型组相比无显著性差异。(6)肝肾组织HE染色结果:与Y组和Q组相比,K组大鼠的肾小球体积略小,肾小囊囊腔明显增大,肾小管管腔扩张伴上皮细胞空泡变性、坏死脱落。EL、EM组部分肾小管肿胀,且伴随上皮细胞损伤脱落,EH组少量肾小管上皮细胞损伤。J组部分细胞排列疏松,肾小管肿胀、扩张伴上皮细胞坏死脱落;各组大鼠肝脏组织HE染色结果未见明显的肝组织病理性变化。(7)血细胞检测结果:与K组对比各组白细胞数、红细胞数、血小板数、红细胞比容和血红蛋白水平均无显著差异(P>0.05)。(8)肝脏抗氧化指标检验:与Y组比较,K组大鼠丙二醛(MDA)含量极显著增加(P<0.001);与K组比较,EZP给药后能够使MDA的含量降低,特别是EH组能够显著下调自然衰老模型大鼠的MDA水平(P<0.05);同时,J组也能使老年大鼠的MDA水平下降,但差异未有明显的统计学意义。随着大鼠年龄增加,超氧化物歧化酶(SOD)活力水平有下降趋势,与K组相比,EZP各剂量组和J组SOD活力水平显现上升趋势,但未达到统计学差异。(9)肝脏端粒长度测定:随着年龄增长,衰老大鼠端粒长度逐渐下降,EZP给药后有回升的趋势,并呈现剂量依赖性。端粒长度的分布在EL组-Y组(调整后P=0.028)、EL组-Q组(调整后P=0.001)的差异有统计学意义,其它组之间的差异无统计学意义。2.二至丸对自然衰老模型大鼠肠道菌群的影响(1)Alpha多样性分析表明,除EM组和Y组微生物群落多样性显著高于K组外(P<0.05),其他各组样本的物种Shannon指数无显著差异;EM、EH和Y组的Simpson指数均高于K组(P<0.05);与K组比较,EM、EH、J、Q、Y组的Chao指数和Ace指数显著减低(P<0.05)。(2)在门水平上,各组大鼠肠道菌群以Firmicutes为主,其次是Bacteroidota和Actinobacteriota。(3)在属水平上,与K组比较,EL组和EH组的Romboutsia丰度显著下降(P<0.05),EM组虽然有下降趋势但差异不显著;EL组和EH组的norank＿f＿＿norank＿o＿＿Clostridia＿UCG-014丰度显著下降(P<0.05),EM组有下降趋势但无显著性差异;EL、EM和EH组的Clostridium＿sensu＿stricto＿1丰度均显著下降(P<0.05);EL、EM组的Allobaculum显著上升(P<0.05),EH组有上升趋势但差异不显著;EL、EM和EH组的UCG-005显著上升(P<0.05);EL、EM和EH组的norank＿f＿＿Eubacterium＿coprostanoligenes＿group显著上升(P<0.05)。(4)COG功能预测涉及碳水化合物、氨基酸及能量代谢,癌症,免疫疾病以及细胞生长和死亡等微生物基因,但主要集中于代谢相关的微生物基因。3.基于肝脏转录组学研究二至丸延缓衰老的作用机制本实验对68个肝脏样品进行转录组测序分析,测序得到531.31 Gb clean data,碱基质量值为30时,正确率在93.62%以上。差异表达基因结果表明,与K组比较,Y组共1687个差异表达基因(DEGs),其中上调DEGs1010个,下调677个;Q组总计590个DEGs,其中上调403个,下调187个;EL组共36个DEGs,其中上调30个、下调6个;EM组总计10个DEGs,上调5个,下调5个;EH组共242个DEGs,其中上调199个,下调43个;J组共34个DEGs,上调18个,下调16个。与K组比较,Y组在类固醇生物合成(Steroid biosynthesis)途径中富集程度最高;Q组在昼夜节律通路(Circadian rhythm)的富集程度最高;EL组在谷胱甘肽代谢(glutathione metabolic pathway)通路上的富集程度最高;EM、EH组在昼夜节律通路富集程度最高;J组初级胆汁酸的生物合成(primary bile acid biosynthesis)通路具有高富集率。q RT-PCR验证的差异基因的表达结果与转录组一致。4.基于血浆代谢组学研究二至丸延缓衰老的作用机制经代谢组学分析,获取幼年大鼠与老年大鼠血浆样本中的生物标志物45个,富集代谢通路11条;EZP高剂量干预自然衰老大鼠血浆样本的19个差异化合物富集得到9条生物通路;金匮肾气丸干预自然衰老大鼠后的25个差异化合物主要富集在7条生物通路。EZP和金匮肾气丸共同显著回调8个差异代谢物质:褪黑激素(Melatonin radical)、肌醇1,4,5—三磷酸(myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate)、廿四碳六烯酸(Tetracosahexaenoic acid)、乙酰磷酸(Acetylphosphate)、甘油二酸酯(DG(15:0/0:0/18:4n3))、尿胆素原(Urobilinogen)、溶血PC(Lyso PC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0:0))、中胆红素原(Mesobilirubinogen),共同参与丙酮酸代谢、卟啉和叶绿素代谢、磷酸肌醇代谢、甘油磷脂代谢、磷脂酰肌醇信号系统生物代谢通路。结论:1.EZP能够缓解自然衰老模型大鼠的衰老症状,提高存活率,并可能通过改善自然衰老模型大鼠免疫功能、抗氧化能力和端粒长度起到延缓衰老的作用且呈剂量依赖性,其中EZP高剂量作用效果较为明显。2.EZP可能改变自然衰老大鼠肠道菌群的结构组成和丰度比例发挥延缓衰老作用,其中高剂量调节肠道菌群延缓衰老效果最佳。3.EZP可能通过上调基因Nr1d1、Hsd17b2、Efna1、Xbp1,下调基因Cdkn1a、Gstt3、Insig1、Lpin1、Tsku、Dpt从而发挥延缓衰老作用,调节自然衰老模型大鼠的癌症通路、昼夜节律通路、PI3K-Akt信号转导等代谢相关通路发挥其延缓衰老的作用,JSP则可能通过初级胆汁酸的生物合成通路发挥延缓衰老作用。4.EZP可能通过作用于视黄醇代谢、丙酮酸代谢、半乳糖代谢、磷脂酰肌醇信号系统、磷酸肌醇代谢、卟啉和叶绿素代谢、甘油磷脂代谢、氨基糖和核苷酸糖等代谢通路发挥其延缓衰老作用,且滋阴方EZP和补阳方JSP可通过多途径调节衰老相关通路发挥延缓衰老作用。5.多组学的联合分析提示EZP给药后的自然衰老大鼠肠道微生物群与宿主代谢密切相关,组学联合的关键通路是昼夜节律通路、PI3K-Akt信号通路和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路。

冷鲜牛肉中假单胞菌和热死环丝菌致腐机制及其光动力杀菌控制研究

这是一篇关于腐败机制,假单胞菌,热死环丝菌,代谢组学,光动力杀菌的论文, 主要内容为冷鲜牛肉是中国居民最常消费的鲜肉之一,牛肉不仅肉质鲜美,还具有高蛋白、低脂肪的优点。然而,冷鲜牛肉在冷链加工和运输中极易受到微生物污染,假单胞菌、热死环丝菌等耐冷菌是引起牛肉组织结构松散和不良气味的优势腐败菌。光动力杀菌是一种无毒低能耗的杀菌技术,具备良好的杀菌效果。为揭示冷鲜牛肉微生物结构演替规律,探究牛肉优势菌假单胞菌和热死环丝菌的致腐互作,研究分析三种不同销售途径的冷鲜牛肉在4℃贮藏期间的菌群结构变化,评价鉴定的优势腐败菌假单胞菌和热死环丝菌致腐能力,比较基因组学分析强弱腐败株的基因结构差异,基于理化指标和HPLC-MS/MS代谢组阐明牛肉糜中假单胞菌和热丝环丝菌单/共接种的致腐特性,并采用光动力杀菌技术进一步评价光动力结合不同包装方式对牛肉糜在冷藏期间品质改善的影响。研究为揭示冷鲜牛肉微生物致腐机制,提高肉品冷链的贮藏品质及型保鲜技术的研发提供新的理论基础。主要结果如下:采用非依赖培养和依赖培养的16S rDNA高通量测序分析菜市场、超市和电商三种销售途径的冷鲜牛肉中微生物群落结构及其演替规律。结果显示,三种销售途径的牛肉微生物菌群种类和丰度大小存在较大差异。菜场牛肉初期微生物种类较多,且各菌属的丰度差异不大,在中后期主要以假单胞菌属、环丝菌属和不动杆菌属为主。超市牛肉的微生物多样性较低,主要以不动杆菌属、发光杆菌属、假单胞菌属、类香味菌属为主;电商平台牛肉微生物多样性最高,在贮藏中后期主要以假单胞菌属、环丝菌属和沙雷氏菌属为主。非依赖培养高通量测序分析菌群种类略多于依赖培养,其中主要的优势菌基本相似,部分细菌种属的丰度发生较大变化,尤其是类香味菌属和沙雷氏菌属,在依赖培养中其丰度远高于非依赖培养。采用HS-SPME-GC-MS分析在牛肉冷藏期间共检测到30种挥发性成分,其中3-甲基-1-丁醇和乙偶姻含量与假单胞菌属和环丝菌属呈正相关。通过4℃牛肉汁中TVB-N、蛋白酶活力和乙偶姻指标评价分离菌株的致腐能力,并比较强弱腐败株的全基因组序列。热死环丝菌BT27(强致腐株)和BT25(弱致腐株)的比较基因组学发现菌株腐败能力的强弱与编码碳水化合物代谢基因数量有关。假单胞菌PF83(强致腐株)和PF57(弱致腐株)的比较基因组学分析显示,两株强弱菌株的编码基因主要涉及氨基酸转运代谢,其腐败潜力与蛋白降解和氨基酸利用有关。鉴于隆德假单胞菌比莓实假单胞菌有更强的致腐性,研究以隆德假单胞菌和热死环丝菌为研究对象,分析两种腐败菌单/共接种于牛肉糜中的腐败特征。通过理化指标评估不同单接种组的腐败特征发现,热死环丝菌能够大量分解糖类产生乙偶姻;隆德假单胞菌能够分解蛋白产生可溶性多肽和TVB-N。在共接种组中,两种菌的腐败特性均受到影响,互相存在竞争作用。HPLC-MS/MS代谢物分析发现热死环丝菌主要通过糖代谢、核酸代谢引起牛肉腐败,隆德假单胞菌主要通过氨基酸代谢导致牛肉腐败。在共接种组中共筛选到409个差异代谢物,4条显著代谢通路,并发现产生新的代谢物。此外,8种关键代谢物肌酸、肌苷、肌苷酸、尿嘧啶、丙氨酸、谷氨酰胺、3-甲基组氨酸和3-羟基癸酸被确定为潜在的腐败标志物。通过分析贮藏间理化指标变化来探究姜黄素介导的光动力杀菌对牛肉微生物和冷藏品质的影响。采用姜黄素浓度单因素实验发现60 μM姜黄素浓度、0.5 mg/mL柠檬酸、光照30 min处理为最佳杀菌条件。将该光动力杀菌条件结合不同包装应用于牛肉糜的品质控制。结果显示,光动力处理组普通包装和真空包装菌落总数在整个贮藏期间始终低于对照组;在贮藏末期光动力处理组可溶性多肽显著低于对照组;其TVB-N的变化趋势与可溶性多肽类似,经处理后牛肉的pH值及ΔE值的上升速度变慢。结果表明,光动力处理抑制微生物的生长从而延缓牛肉蛋白质的降解,达到对牛肉的保鲜效果。综上,冷鲜牛肉的微生物群落结构及其演替规律与其销售途径有关,牛肉在4℃冷藏期间优势腐败菌包括假单胞菌属、不动杆菌属、发光杆菌属、环丝菌属、沙雷氏菌属、类香味菌属。假单胞菌和热死环丝菌强弱腐败株差异与其参与代谢功能的编码基因数量有关。热死环丝菌以碳水化合物代谢形成乙偶姻,隆德假单胞菌主要以氨基酸代谢为主,两者在共接种体系中形成更多的腐败代谢产物,并表现竞争性作用,其中组氨酸代谢参与两种优势菌致腐代谢。姜黄素介导的光动力对两种优势菌表现良好的杀菌效果,结合不同包装方式能有效降低牛肉中假单胞菌和热死环丝菌生长,延缓蛋白质降解和色泽变化,对牛肉具有良好的保鲜作用。