苏云金芽胞杆菌支链氨基酸和3-羟基丁酮代谢途径的诱导调控机制
这是一篇关于苏云金芽胞杆菌,BkdR,AcoR,支链氨基酸,3-羟基丁酮的论文, 主要内容为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thurigiensis,Bt)属蜡样芽胞杆菌族,是革兰氏阳性细菌,在芽胞形成过程中会产生杀虫晶体蛋白,对多种鳞翅目和鞘翅目等昆虫都有特异性的毒杀活性,因其具有对昆虫的天敌安全,对人畜无毒害作用,对环境无污染等优点,作为一种生物农药在农业和林业中被广泛使用。本实验室前期研究发现,在Bt HD73菌株中有8种增强子结合蛋白(EBPs),调控多种代谢途径,包括γ-氨基丁酸代谢、赖氨酸代谢、肌氨酸代谢等,其中Bkd R调控bkd基因簇的转录,可能与支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)的代谢相关,Aco R调控aco基因簇的转录,可能与3-羟基丁酮的代谢相关。支链氨基酸和3-羟基丁酮的降解产物最终都进入三羧酸循环,本文针对Bt HD73菌株中的支链氨基酸和3-羟基丁酮代谢途径的诱导调控机制进行研究。主要结果如下:通过β-半乳糖苷酶活性分析和凝胶阻滞(EMSA)的方法,明确了在SSM和LB培养基中,bkd基因簇启动子Pptb的转录活性不受支链氨基酸的诱导,而在M9基础培养基中,支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)可诱导Pptb的转录活性。bkd基因簇的诱导转录活性受Bkd R直接正调控。β-半乳糖苷酶活性测定结果表明3-羟基丁酮可诱导aco基因簇启动子PacoA的转录活性。PacoA诱导转录活性受Sigma54控制,并受Aco R正调控。通过EMSA、DNase I footprinting和β-半乳糖苷酶活性分析等方法,明确了Aco R的HTH结构域与aco A上游一段30 bp的回文序列结合;GAF结构域在感应3-羟基丁酮信号过程中起作用。通过序列分析、β-半乳糖苷酶活性测定分析和EMSA的方法,明确了葡萄糖抑制bkd基因簇和aco基因簇的转录,Ccp A在此过程中起负调控作用。通过明确支链氨基酸和3-羟基丁酮代谢途径的诱导调控机制,丰富了EBPs调控的代谢网络,为从代谢角度研制新一代工程菌提供理论依据。
苏云金芽胞杆菌spoIIID突变体中高活性启动子的分析
这是一篇关于苏云金芽胞杆菌,spoIIID基因,母细胞裂解,启动子,cwlC的论文, 主要内容为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)属于蜡样芽胞杆菌属(B.cereus group),是一种可以产生芽胞与伴胞晶体的革兰氏阳性细菌。晶体和芽胞的混合物可以作为制剂在田间应用,但在应用过程中释放的晶体在自然条件下不稳定易失活,芽胞的大量释放可能存在一定的生态风险。前期研究发现,spoIIID基因的缺失使细胞不产生芽胞,但是关于spoIIID基因对母细胞裂解与晶体产量的影响还未有报道。本研究主要展开了spoIIID突变体中Cry蛋白表达和细胞裂解的研究工作:1.利用β-半乳糖苷酶活性检测启动子活性,发现在Bt中SpoIIID,σE和σK之间的转录调控关系与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis,简称Bs)中相同,SpoIIID正调控sigK,σK反过来抑制sigE基因的转录。光学显微镜观察发现spoIIID基因的缺失影响母细胞的裂解并受到不同营养条件的影响,在SSM与LB培养基中母细胞不裂解,而在1/2 LB培养基中裂解。在SSM与1/2 LB培养基中进一步分析了cwlC(母细胞裂解的关键基因)的转录活性,在两种培养基中cwlC在野生株中的转录活性均远远高于在突变株中,且在1/2 LB培养基中cwlC的转录活性略高于在SSM中。因此在spoIIID突变的基础上,通过同源重组的方法对cwlC基因进行了敲除,获得的双突变株HD(ΔspoIIID)(ΔcwlC)在任何培养基中均不裂解也不产生芽胞。2.在HD73菌株中spoIIID基因的缺失降低了Cry1Ac杀虫晶体蛋白(其启动子有依赖于σK的活性)的产量,将只依赖于σE的orf1cry8E与5014两个强启动子导入spoIIID突变株,两个启动子在spoIIID突变株中的转录活性与HD73野生株相比基本相当,说明spoIIID突变体中两个启动子均具有很高活性。SDS-PAGE与对小菜蛾的杀虫活性结果显示,在HD-(ΔspoIIID)中orf1cry8E和5014启动子可以指导cry1Ac产生与HD73野生株等量的晶体蛋白,且对小菜蛾的杀虫活性与野生株相当。3.通过基因芯片数据分析了spoIIID突变株中转录活性高的基因,构建了相应启动子与lacZ的融合表达载体,进行了β-半乳糖苷酶活性检测,结果表明未发现比orf1cry8E和5014启动子具有更高活性的启动子,有待进一步筛选。通过生物信息学分析了Bt中可能受到SpoIIID调控的基因,并完成了SpoIIID蛋白的表达纯化,为确定SpoIIID的调节子奠定了基础。本研究在spoIIID缺失的遗传背景下分析了启动子的活性和对母细胞裂解的影响,筛选到两个高活性启动子可用于此遗传背景下的表达元件;同时获得的双突变株具有不产生芽胞和母细胞不裂解的特性,这种构建方法为Bt工程菌株改良提供了一种新策略。
苏云金芽胞杆菌MEP代谢途径相关基因的转录调控研究
这是一篇关于苏云金芽胞杆菌,MEP代谢途径,转录调控,DXR的论文, 主要内容为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringensis,Bt),是一种革兰氏阳性细菌,在生成芽胞的同时还产生对多种农林害虫有杀虫活性的伴胞晶体,是应用最广的微生物杀虫剂。萜类化合物广泛分布在生物界,是重要的生命物质。目前发现有两条萜类化合物的生物合成途径,即甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径。Bt中有8个基因编码MEP代谢途径相关的酶,本文对这些基因的转录调控进行研究。主要取得了如下结果:生物信息学分析发现,Bt中有8个基因编码MEP代谢途径相关的酶,它们是:dxs基因(HD734479)编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶,dxr基因(HD733605/dxr1和HD734104/dxr2)编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶,ispD(HD730085)基因编码2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷转移酶,ispE(HD730043)基因编码4-胞啶-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶,ispF(HD730086)基因编码2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-二磷酸合成酶,ispG(HD734584)基因编码4-羟基-3-甲基-2-烯基二磷酸合酶,ispH(HD734593)基因编码4-羟基-3-甲基-2-烯基二磷酸还原酶,fni(HD731728)基因编码异戊烯二磷酸异构酶。这些基因在枯草芽胞杆菌中都有同源基因。通过RT-PCR和5’RACE实验,确定了dxs基因与其下游基因形成一个转录单元,转录起始位点(TSS)位于dxs的起始密码子GTG上游133bp处的G碱基;dxr1(HD733605)基因单独形成一个转录单元,TSS位于dxr1的起始密码子ATG上游39 bp处的G碱基;dxr2(HD734104)基因与其上下游的9个基因形成一个转录单元,TSS位于所在基因簇第一个基因(HD734110)的起始密码子ATG上游116 bp处的G碱基;ispD和ispF基因所在的基因簇由5个基因组成,形成一个转录单元,TSS位于所在基因簇第一个基因(HD730084)的起始密码子ATG上游11bp处的G碱基;ispE基因与其上下游的3个基因形成一个转录单元,TSS位于所在基因簇第一个基因(HD730041)的起始密码子ATG上游138 bp处的G碱基;ispG基因所在的基因簇由3个基因组成,形成一个转录单元,TSS位于所在基因簇第一个基因(HD734582)的起始密码子ATG上游25 bp处的A碱基;ispH基因与其上游基因形成一个转录单元,TSS位于所在基因簇第一个基因(HD734592)的起始密码子ATG上游24 bp处的A碱基;fni基因与其上游基因形成一个转录单元,TSS位于所在基因簇第一个基因(HD731727)的起始密码子ATG上游76 bp处的C碱基。构建了MEP代谢途径相关基因的启动子融合lacZ报告基因的表达载体,并在Bt HD73菌株中测定了β-半乳糖苷酶活性,结果表明:在SSM培养基中,从T1到T8时期这些启动子都有转录活性。转录活性分析表明,dxr1基因的转录受SigH控制。dxr1或dxr2基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无显著影响,但使DXR活性下降。
苏云金芽胞杆菌cry1Ac基因的表达调控
这是一篇关于苏云金芽胞杆菌,cry1Ac启动子,exsY启动子,表达载体,Cry1Ac蛋白的论文, 主要内容为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性产芽胞菌,广泛分布于自然界中,属于蜡样芽胞杆菌族(B. cereus group). Bt在营养成分不足时可产生芽胞,同时产生伴胞晶体(由Cry和Cyt蛋白组成)。B. thuringiensis subsp. kurstaki HD73菌株中仅含有一种cry基因即cry1Ac基因。crylA类基因的转录由芽胞期Sigma因子SigmaE和SigmaK控制。 本课题组前期研究发现crylAc基因在生长过渡期有较弱的表达,启动子截短实验确定crylAc启动子截短活性的关键区域为crylAc基因ATG上游317bp到368bp。同时构建crylAc启动子(含有252bp结构基因)与lacZ基因融合的表达载体,p-半乳糖昔酶活性显示,编码区的存在提高了crylAc启动子的转录活性。以上结果均表明crylAc基因的调控机制非常复杂,有待深入研究。 本研究采用DNA亲和层析法寻找与crylAc启动子相互作用的蛋白,发现3种转录因子HD733743、HD730689和HD730242可与crylAc启动子结合。HD733743蛋白和HD730689蛋白可能是一种ArsR家族转录调控因子;HD730242蛋白可能是一种氧化还原阻遏因子Rex。采用同源重组技术分别筛选得到突变体HD(Δ3743)、HD(Δ0689)和HD(Δ0242)。在LB和SSM培养基中测定HD(Δ3743)、HD(Δ0689)和HD(Δ0242)突变体的生长曲线,结果发现HD733743、HD730689和HD730242基因的缺失对菌株的生长无明显影响；通过lacZ融合启动子活性分析发现crylAc启动子在HD(Δ3743)、HD(Δ0689)和HD(Δ0242)突变体中的转录活性与野生型相比无明显变化,说明上述基因的缺失对crylAc启动子的转录活性无显著影响；UD(Δ0689)和HD(Δ0242)突变体与野生型相比芽胞形成率无显著差别,说明HD730689和HD730242基因的缺失对芽胞的形成无显著影响。 本研究探索了用非cry基因启动子指导Cry蛋白的表达。ExsY是芽胞外壁的基质结构蛋白,与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中CotZ同源,芽胞晚期开始合成,由σK控制。本研究在发现exsY启动子在晚期活性非常高的基础上,构建了由非cry类基因启动子exsY驱动的crylAc基因表达载体,发现在Bt无晶体突变体中,Cry1Ac蛋白能正常表达,且能形成双锥体晶体,本研究为Cry晶体蛋白表达提供新思路。
苏云金芽胞杆菌精氨酸利用途径的转录调控研究
这是一篇关于苏云金芽胞杆菌,精氨酸代谢,转录调控,RocR,Sigma54的论文, 主要内容为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis),简称Bt,能够产生多种杀虫晶体蛋白,对多种农作物害虫具有杀虫活性,因此Bt作为微生物杀虫剂被广泛应用于生物防治领域。实验室前期研究发现,在Bt HD73菌株中,Sigma 54因子的缺失会影响菌株的生长及伴胞晶体的产量。Sigma 54调控菌株生长繁殖过程中的多种代谢途径,而这些依赖于Sigma 54的基因的转录还需要增强子结合蛋白(Enhance Binding Protein,EBP)的激活。在HD73菌株中含有8种EBP,分别调控不同的代谢途径。本研究主要对Bt HD73菌株中Roc R可能调控的精氨酸代谢途径相关的roc基因簇的转录调控机制进行研究。主要结果如下:生物信息学分析表明,Bt HD73菌株中有7个roc基因编码精氨酸分解代谢相关酶类。分别是:roc C(HD73＿2990)和roc E(HD73＿0562)编码精氨酸通透酶(arginine/ornithine permease);roc F(HD73＿0154)编码精氨酸酶(arginase);roc D(HD73＿1314)编码鸟氨酸转氨酶(ornithine aminotransferase);roc A(HD73＿0352)编码吡咯啉羧酸脱氢酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase);roc G(HD73＿1719)编码谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase),roc B(HD73＿2992)为精氨酸利用蛋白(arginine utilization protein)。转录调控因子Roc R由roc R(HD73＿0559)基因编码。Roc R具有三个典型的结构域:与DNA结合的HTH结构域,与Sigma 54因子结合的AAA+结构域,与信号感应相关的PAS结构域。RT-PCR结果表明,7个roc基因分别属于7个不同的转录单元。β-半乳糖苷酶活性分析发现roc E基因的转录受精氨酸的诱导,受Sigma 54的控制,并受Roc R的正调控。EMSA实验表明,Roc R蛋白的HTH结构域能够与roc E启动子直接结合,说明Roc R通过直接结合roc E启动子从而调控roc E的转录。在SSM培养基中,roc A,roc C,roc D,roc F基因的转录不受Roc R的调控。通过同源重组的方法,获得roc C,roc D,roc E,roc F基因的缺失突变体。通过生长曲线、Cry1Ac蛋白产量、芽胞形成率、光学显微镜观察细胞形态等表型分析发现,roc E基因的缺失不影响菌株的生长及晶体蛋白产量,但降低芽胞形成率;roc C基因的缺失影响菌株的生长,使菌体内部的内容物增多,晶体形成减少。这些结果说明精氨酸代谢途径与芽胞形成相关,精氨酸代谢途径的缺失会影响Cry1Ac晶体的形成。精氨酸是菌体生长过程中的重要氮源物质,精氨酸代谢产物也是连接菌株中氮代谢与碳代谢的重要物质。通过对精氨酸代谢途径转录调控机制的解析,可以从代谢调控的方面,通过对培养基营养组分的优化来提高菌株对氮源和碳源的利用,为获得提高杀虫晶体产量的新一代Bt制剂提供科学依据。
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