三唑并四嗪类c-Met小分子抑制剂的设计、合成及生物活性研究

这是一篇关于三唑,四嗪,c-Met抑制剂,抗肿瘤活性,分子对接的论文, 主要内容为长期以来,各种恶性肿瘤对人类的生命健康造成了持续而严重的危害。尽管人类的诊断技术和治疗水平不断在发展和进步,但是很多肿瘤患者的生存率仍然很低。广泛的临床前和临床试验研究已经证明,c-Met抑制剂对于多种癌症的治疗均具有良好的抗肿瘤效果。因此,开发结构新颖且具有更好溶解性和抑制活性的c-Met抑制剂是十分重要的。我们以三唑并四嗪为基本骨架,在其3位或6位装配合适的“双臂”,杂合现有的c-Met抑制剂的活性药效团,设计并合成了3个不同系列的结构类似物,共计合成22个新化合物,然后将制备得到的目标化合物及其中间体采用1H-NMR、13C-NMR、IR、LC-MS、HRMS等分析仪器确证结构。利用已有的体外抗肿瘤活性评价的细胞模型,选择A549、AML12、CaCo-2、EGC、HepG2、HT-29、BeWo、MCF-7等8种细胞系,采用MTT法对合成的三唑并四嗪类化合物进行体外抗肿瘤活性的评价。对于合成的系列Ⅰ化合物而言,其中化合物4g(12.69±7.14μM for HT-29)表现出显著的体外抗肿瘤活性。对于合成的系列Ⅱ化合物而言,其中化合物7a、7b、7c、7d、7f、7g(3.47-11.06μM for A549)对于A549细胞的抗肿瘤活性均优于顺铂(13.33μM for A549);化合物7b、7c、7f、7g(10.62-12.94μM for HT-29)对于HT-29细胞的抗肿瘤活性同样均优于顺铂(14.01μM for HT-29)。对于合成的系列Ⅲ化合物而言,其中化合物4a(1.21μM forA549,0.68μM for Bewo,3.74μM for MCF-7)显示出最强的生物活性,优于阳性对照顺铂(9.97μM for A549,10.46μM for Bewo,15.03μM for MCF-7)。通过均匀时间分辨荧光免疫测定(HTRF)对系列Ⅲ中的化合物4a、4b和4f进行c-Met激酶抑制活性的测试。从计算的结果可知,和阳性对照星形孢菌素(0.042μM for c-Met kinase)相比,化合物4a、4b和4f显示出强大的c-Met激酶抑制活性,IC50值分别为16.81、16.34和10.77μM,这表明这些合成化合物的强大抗肿瘤活性可能与其c-Met酶抑制活性相关。采用Tripos公司的Sybyl-X 2.0软件下的Suflex-Docking模块,将系列Ⅲ中化合物4a、4b和4f插入c-Met激酶的结合位点来进行分子对接模拟,4a和c-Met激酶(3EFJ)之间的分子对接结果表明,该化合物是c-Met蛋白激酶的潜在抑制剂。本课题的主要创新之处在于:(1)在三唑并四嗪骨架“U型”结构理论的基础上,对砌块中“双臂”和“U型”张角进行计算机辅助设计和虚拟筛选,指导目标化合物库的构建;(2)对三唑并四嗪骨架中3位或6位以氧、硫等杂原子取代的化合物活性的考察揭示了分子刚性及其对c-Met的抑制活性之间的关系;(3)本项目综合应用药物设计、有机合成、生物学和药物设计辅助软件等交叉学科方法,通过构建3D-QSAR模型,在课题研究过程中的相互反馈和循环验证,不断优化药物设计,极大的提高了研发的效率。综上所述,由喹啉氧基连接的系列Ⅱ化合物和系列Ⅲ中的化合物4a,都值得后续进一步的研究和拓展,为开发该类化合物成抗癌新药提供重要理论和实验依据。

基于靶点预测研究香蜂草苷抗LPS联合D-Gal致小鼠急性肝损伤的作用及其机制

这是一篇关于香蜂草苷,急性肝损伤,分子对接,炎症的论文, 主要内容为目的通过靶点预测及分子对接技术对香蜂草苷治疗急性肝损伤的靶标信号通路及关键蛋白,并在此基础上探讨靶标通路(PI3K/Akt通路)、凋亡和炎症对香蜂草苷治疗脂多糖联合D-氨基半乳糖胺(Lipopolysaccharide/DGalactosamine,LPS/D-Gal)所致急性肝损伤(Acute liver injury,ALI)的影响及其调控作用机制。方法1.急性肝损伤及香蜂草苷靶点的收集通过Gene Cards、Disgenet网站收集急性肝损伤的靶点,针对Gene Cards数据库收集到的数据,取四分位数以上基因进行下一步操作。同时,利用Ctdbase、Pharmmapper、Target Net、SEA网站收集香蜂草苷的靶点,将收集到的信息分别通过Uni Prot Knowledgebase进行转换成Gene name以进行下一步操作。2.交集靶点蛋白-蛋白互作网络(protein-protein interaction network)分析利用基迪奥生物平台中的维恩图程序对急性肝损伤和香蜂草苷的靶点数据进行分析。点击进入“multiple proteins”栏,将所得到的交集数据上传至STRING网站并提交分析,再用Cytoscape对所得结果进行进一步计算及美化。3.KEGG通路富集分析通过Cytoscape中Cytohubba对STRING网站中分析所得的结果进行进一步分析及评分,保留参与构建网络的靶点基因,并将上传至David网站中进行KEGG通路富集分析。4.通路蛋白与香蜂草苷分子对接分析在Uni Prot Knowledgebase网站上搜索相关通路蛋白的序列,并通过Swiss-model进行同源建模,下载最终PDB结构的蛋白。随后用Pymol进行前处理(去水、去配体)香蜂草苷的3D分子结构将从Pub Chem上下载。最后通过Auto Dock进行分子对接,计算结合能。5.诱导建立ALI小鼠实验模型90只6-8周的雄性C57BL/6J小鼠随机分成6组:正常组(等体积生理盐水)、香蜂草苷对照组(0.8 mg/kg)、急性肝损伤模型组(等体积生理盐水)、联苯双酯阳性对照组(175 mg/kg)和香蜂草苷低、高剂量组(0.4、0.8 mg/kg),连续灌胃给药15天,每天一次。末次给药1 h后,除正常组和香蜂草苷对照组外,其余各组小鼠均接受腹腔注射LPS(50μg/kg)联合D-Gal(800 mg/kg)建立小鼠急性肝损伤的模型。注射4 h后,采集血样及肝脏标本存储于适宜条件下,以备作进一步检查。6.香蜂草苷对ALI小鼠肝脏损伤的影响采用全自动生化分析仪检测香蜂草苷对各组小鼠血清中谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)水平的影响;H&E染色检测小鼠肝脏病理结构改变。7.香蜂草苷对ALI小鼠血清氧化应激和炎症指标的检测采用市售试剂盒检测小鼠血清中的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(Maleic diadehyde,MDA)的含量,并检测小鼠肝脏中的诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)的活性。采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平。8.香蜂草苷对ALI小鼠肝细胞凋亡的影响采用TUNEL检测香蜂草苷对急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响,并通过western blot法检测Bax、Bcl-2等蛋白的表达。9.PI3K/Akt信号通路和TLR4/NF-κB信号通路活化的检测采用Western blot法检测PI3K、Akt、PTEN、m TOR、TLR4、My D88、NF-κB等蛋白的表达;并用过q RT-PCR法检测关键基因的表达。结果1.靶点基因总数及交集数经处理后,于Gene Cards、Disgenet数据库搜索到急性肝损伤的靶点共有1014个;于Ctdbase、Pharmmapper、Target Net、SEA网站收集香蜂草苷的靶点共有788个。急性肝损伤与香蜂草苷的交集基因共有146个。2.预测hub基因经STRING构建PPI网络共剩余143个靶点基因,利用Cytohubba对其进行分析,计算相关参数。根据Degree算法可得,所有基因的分值在1～97之间,评分排名前十的基因有:Akt1、Tnf、Mapk3、Casp3、Egfr、Mmp9、Ccnd1、Mapk8、Src。3.KEGG通路富集分析结果采用KEGG通路富集分析对交集靶点进行分析后,共得到92条相关信号通路,其主要包括:癌症通路、PI3K/Akt信号通路、癌症中蛋白核聚糖通路、前列腺癌通路等。4.分子对接结果通过对分子对接结果的分析,本研究发现香蜂草苷可与Akt、PI3k、TLR4、NF-κB等蛋白自然结合,其中Akt与IKK-α这两个蛋白与香蜂草苷结合更为紧密,其二者的结合能分别为:-11.29 kcal/mol和-6.60 kcal/mol。5.LPS联合D-Gal成功诱导建立急性肝损伤模型腹腔注射LPS和D-Gal后,小鼠血清中AST和ALT异常升高(P<0.01),肝脏体积明显增大,颜色加深。病理学检查结果显示,腹腔注射LPS和DGal后,小鼠肝细胞水肿,组织充血,可见明显点状或局灶性坏死,肝索消失,肝小叶结构严重破坏,可发现炎症细胞浸润及中央静脉不规则扩张。6.香蜂草苷明显减轻LPS/D-Gal诱导所致ALI的损伤程度通过HE染色结果可知,香蜂草苷预处理可以明显减轻肝脏肝细胞坏死程度,保护肝组织结构完整。采用全自动生化分析仪对小鼠血清中各项指标进行分析后发现,香蜂草苷治疗组可明显降低LPS/D-Gal处理后血清中异常升高的AST和ALT活性(P<0.01)。7.香蜂草苷明显抑制ALI小鼠氧化应激及炎症反应的发生通过分析对应市售试剂盒检测结果,发现香蜂草苷可以明显改善LPS/D-Gal处理后肝脏中SOD和GSH-Rd大幅度降低的异常表达(P<0.01);同时香蜂草苷还能降低小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.01或P<0.05),抑制肝组织中TNF-α基因的表达(P<0.01),减少肝组织中IL-6蛋白的表达(P<0.01);还能降低LPS/D-Gal处理后肝脏中异常增高的MPO、MDA、i NOS的活性(P<0.01)。q RT-PCR结果显示,香蜂草苷可显著降低LPS/D-Gal处理后异常增高表达的TNF-α基因的水平(P<0.01)。8.香蜂草苷明显减轻小鼠肝细胞凋亡TUNEL染色法结果显示,香蜂草苷可明显减轻LPS/D-Gal处理后肝脏中肝细胞的凋亡;Western blot法检测结果显示,香蜂草苷可以明显改善Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达(P<0.01)。9.香蜂草苷可以抑制PI3K/Akt通路和TLR4/NF-κB通路的活化Western blot法检测结果显示,香蜂草苷可以抑制这两条信号通路中P70S6K、TLR4、NF-κB和My D88的表达(P<0.01);同时,香蜂草苷还能减少肝脏中PI3K、Akt、m TOR、IKKα/β和IκB蛋白的磷酸化水平。q RTPCR结果显示,香蜂草苷可显著降低善LPS/D-Gal处理后肝脏中异常升高的NF-κB、Akt和PI3K基因的表达水平。结论1.生物信息学和分子对接预测香蜂草苷可能通过调节PI3K/Akt信号通路的活化从而起到治疗急性肝损伤的作用,其靶点蛋白可能为Akt和IKKα。2.动物实验验证香蜂草苷对LPS/D-Gal诱导所致的急性肝损伤具有一定的保护作用,能减轻小鼠肝脏的损伤,其可能机制为:香蜂草苷可能通过抑制PI3K/Akt信号通路和TLR4/NF-κB信号通路的活化从而减少炎症反应的发生,抑制肝细胞的凋亡并缓解机体氧化应激的损伤,从而增强肝细胞的存活能力,抵御外界有害刺激。

基于网络药理学和分子对接探讨柴胡治疗肝硬化作用机制的研究

这是一篇关于肝硬化,柴胡,网络药理学,分子对接的论文, 主要内容为目的肝硬化是由一种或多种病因激发并伴随多种肝功能障碍的慢性肝病。肝硬化临床发病率高,危害大,除肝移植外,目前西医并无治疗肝硬化的切实办法,常采用保肝、抗病毒等疗法。但治疗费用高昂,长期用药易产生抗药性,也会损伤消化系统功能,加重肝肾负担,疗效不佳。中医治疗却有独特的疗效。本研究利用网络药理学方法并结合分子对接技术探究中药柴胡治疗肝硬化的活性成分和作用靶基因,并推断其作用机制。从而为柴胡治疗肝硬化的实验及临床研究提供依据。方法采用中药系统药理学分析平台(TCMSP)筛选出柴胡的化学成分和相关靶点,再将靶点输入Uni Prot数据库对靶点进行标准化。从Dis Ge Net、Gene Cards数据库筛选出肝硬化的疾病基因,再由在线软件venny2.1.0分析并导出共同靶基因。使用Cytoscape3.8.2软件建立“柴胡活性化合物-靶基因”网状图,STRING数据库生成蛋白互作网络,PPI拓扑分析并筛选出核心靶基因。导入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析,采用R程辑包(tidyr、stringr、ggpubr、ggplot2)对GO分析结果以及KEGG分析结果进行可视化。最后利用软件Auto Dock Tool1.5.6对核心靶基因与柴胡活性成分进行分子对接,以此检验活性成分与核心靶基因的结合性能。结果从TCMSP数据库筛选出柴胡的有效活性成分17种,分别为:3,5,6,7-四甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)色酮、山柰酚、乙酸芳樟酯、槲皮素、豆甾醇、茵陈黄酮、黄芩苷、异鼠李素、柴胡皂苷、龙胆素A、曲克芦丁、牵牛花色素、α-谷甾醇、川白芷内酯、羟基羽扇豆烷宁、荜澄茄素、Sainfuran,这17种成分分别作用于194个靶点。从Gene Cards和Dis Ge Net数据库筛选出肝硬化相关基因4754个。基于venny2.1.0获取柴胡与肝硬化共同靶基因159个。通过PPI分析并筛选获得15个核心靶基因,分别为:AKT1,TP53,IL6,TNF,VEGFA,JUN,IL1B,CASP3,HIF1A,MYC,EGFR,PTGS2,EGF,MMP9,CCND1。GO富集分析获得细胞表面受体信号通路等生物进程共615条、粘着斑等细胞组分共65条、蛋白二聚活性等分子功能共121条。KEGG分析得到通路130条,其中高度相关通路包括癌症途径、乙型肝炎、TNF信号通路等。分子对接结果显示乙酸芳樟酯与PTGS2、EGF结合良好,山柰酚与CASP3、JUN、TNF结合良好好,槲皮素与MYC、EGFR、CCND1结合良好。结论柴胡可通过乙酸芳樟酯、山柰酚、槲皮素影响肝硬化的多个靶点,从而起到治疗肝硬化的作用,其关键靶基因为PTGS2、EGF、CASP3、JUN、TNF、MYC、EGFR、CCND1。相关通路为hsa05200癌症途径、hsa05161乙型肝炎、hsa04668 TNF信号通路。本研究可为深入阐明柴胡治疗肝硬化机制提供理论依据。

基于网络药理学和分子对接方法的阿司匹林、伊曲康唑抗白念珠菌感染协同作用机制研究

这是一篇关于阿司匹林,伊曲康唑,白念珠菌,网络药理学,分子对接的论文, 主要内容为目的:1.基于网络药理学初步阐释阿司匹林与伊曲康唑抗白念珠菌感染的协同作用机制,为临床治疗提供新思路;2.结合分子对接技术将网络药理学中筛选出的关键靶点进行初步验证,进一步探索关键靶点在阿司匹林、伊曲康唑治疗白念珠菌感染中的作用。方法:1.网络药理学方法:(1)在Swiss Target Prediction数据库、Target Net数据库、Drug Bank数据库、CTD数据库中检索阿司匹林、伊曲康唑靶点基因;在Gene Cards数据库、OMIM数据库中检索白念珠菌靶点基因。(2)在Venny2.1.0中,查找阿司匹林、伊曲康唑和白念珠菌三者靶点基因的交集基因,利用String数据库初步构建蛋白-蛋白互作网络图(Protein-protein interaction,PPI),在Cytoscape 3.8.2软件中运用cyto Hubba计算并依据Degree数值筛选出排名前五的关键靶点。(3)通过Metascape对交集靶点基因进行基因本体(Gene ontology,GO)功能分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,探索药物治疗潜在靶点在生物过程、细胞组分、分子功能方面发挥的作用。2.分子对接技术:利用Chem Office软件、Py MOL软件、Auto Dock软件、PDB数据库,将网络药理学中筛选出的排名前五的关键靶点与阿司匹林、伊曲康唑进行分子对接。结果:1.通过网络药理学,共筛选出阿司匹林靶点883个、伊曲康唑83个、白念珠菌1737个,交集靶点194个。PPI图显示关键靶点为TNF、IL-6、AKT1、ALB、IL-1β。GO分析表明交集靶点主要涉及炎症反应、免疫反应、信号受体激活剂活性等方面。KEGG分析表明主要涉及NF-κB、HIF-1、T细胞受体信号通路、中性粒细胞胞外陷阱等信号通路。NF-κB信号通路、HIF-1α信号通路可能是阿司匹林、伊曲康唑协同抗白念珠菌感染的潜在靶点。2.通过分子对接技术,TNF-α、IL-6、AKT1、ALB、IL-1β与阿司匹林、伊曲康唑结合良好。其中TNF-α、IL-1β可能是阿司匹林、伊曲康唑发挥协同作用的潜在靶点。结论:阿司匹林、伊曲康唑抗白念珠菌感染作用机制复杂。本课题研究发现TNF-α、IL-1β/NF-κB/HIF-1α信号通路可能是阿司匹林、伊曲康唑发挥协同作用机制的潜在靶点,从而为后续开发抗真菌药物提供了新的靶点,也为解决当前抗真菌药物耐药问题带来了新的前景。但需要后续实验进一步去验证。

光遗传学系统生物信息数据平台的搭建及荧光蛋白UnaG的再设计

这是一篇关于光遗传学系统,数据库,分子动力学模拟,分子对接,蛋白设计的论文, 主要内容为在生物医药领域,如何准确、高效的调节生物过程具有重要的研究价值。近年来,光遗传学技术实现了在细胞水平上精准调控生物信号和蛋白功能,展示出广阔的应用前景。光遗传学整合了光学和遗传学的优点,通过在细胞水平靶向表达光感应蛋白和功能蛋白,并以特定波长荧光蛋白示踪,再利用特定波长的光信号诱导光感应蛋白结构和功能发生变化从而影响功能蛋白的作用,进而达到准确调节细胞信号的目的。光感应蛋白和荧光蛋白都需要吸收特定波长的光才能发挥作用,基于光学和生命科学的融合发展,本论文构建了一套全面的光遗传学系统生物信息数据平台,并针对一类荧光蛋白开展了再设计研究,为开发新型光遗传学系统奠定了数据基础。具体内容如下:第一部分:建立了首个开放收录光遗传学系统(Optogenetic System,OS)的生物信息数据平台——OPSIMO。光遗传学的概念在2005年由斯坦福大学Karl Deisseroth教授首次提出,经过近二十年的发展,目前已经有大量的光感应蛋白组成OSs用于科学研究和疾病诊治,但目前缺乏系统收录OSs的数据库平台,查找相关数据费时费力。因此收集、汇总、整理相关信息并搭建光遗传学系统的数据库对推动光遗传学的发展具有重要的意义;本部分工作对光遗传学系统及其应用进行了系统的文献调研,共收集了605个光遗传学系统,这些光遗传学系统由354个光感应工具(由光感应蛋白、辅因子和伴侣蛋白三者组成)和474个受调控蛋白组成。相关信息包括:光感应蛋白的名称、序列、结构;辅因子的结构式、分子量、化学式;伴侣蛋白的名称、序列;受调控蛋白的名称、序列、类型,光遗传学系统的表达信号(荧光蛋白示踪)、(去)活化的波长、(去)活化的时间、表达的细胞、表达方法、应用、可逆性等。这些信息均收录于OPSIMO数据库的相关页面。此外,基于不同种类光感应蛋白的特性,对具有代表性的光感应蛋白进行了进一步的分析。第一,对视蛋白进行了多序列比对,结果表明视蛋白在序列上有8个保守残基,从结构上看,这些保守氨基酸均位于辅因子结合口袋附近,对辅因子和蛋白的结合具有重大作用;第二,基于网络分析工具Cytoscape对隐花色素类的光感应蛋白进行了网络分析,结果表明光感应蛋白可一对多地用于调节功能蛋白信号;第三,对OS的应用的统计分析表明:虽然目前已有大量的光遗传学系统被作为工具开发,但是用于疾病治疗的光遗传学系统还非常有限,随着研究的深入,必将有更多的光遗传学系统用于不同疾病的诊治过程当中。第二部分:运用计算模拟方法设计新的绿色荧光蛋白Una G。荧光蛋白的出现使生物学家可以直接监测生物体内的动态生命过程。Una G是一种绿色荧光蛋白,发现自日本鳗鲡中,已有研究证实Una G可以特异性结合UC-BR并在光激发后发射出不依赖氧的绿色荧光,可用于检测血液中血清素代谢物浓度。但位于57位的天冬酰胺和2位的缬氨酸都会影响其荧光强度。该部分研究旨在通过再设计Una G发现多样性的绿色荧光蛋白。基于晶体结构,我们通过计算模拟的方法得到了全新的Una G序列,并采用分子对接综合评估了设计的荧光蛋白和UC-BR的结合能力,结果表明再设计时保留“Hot Spots”和“Warm Spots”总体上能得到结合亲和力较高的Una G。我们的方法为后续开发新的荧光蛋白提供了选择。综上,本文对光遗传学系统进行了系统的生物信息学分析,并针对绿色荧光蛋白Una G开展了探索研究。首先,通过文献调研综合数据库检索的方法收集了大量关于光遗传学系统的信息,并将其收录于OPSIMO数据中,再对相关数据进行了详细的分析,由于快速掌握光遗传学系统的相关信息对开发和改进光遗传学系统具有非常重要的作用,OPSIMO作为基础平台为开发新光遗传学系统奠定了坚实的数据基础;其次,利用计算模拟的方法对绿色荧光蛋白Una G进行了再设计,并评估其对UC-BR结合力的影响,为进一步开发多样性的UC-BR检测试剂提供了理论依据。