白皮松种质资源评价及优良单株指纹图谱构建

这是一篇关于白皮松,SNP标记,群体遗传学,EST-SSR,指纹图谱的论文, 主要内容为白皮松是中国特有的濒危树种,目前白皮松的生境已遭到非常严重的片段化威胁,一些独特或稀有的基因存在丢失风险,加之其天然群体的更新较为困难,其长期的进化和正常的演化进程受到阻碍,分布区内许多天然群体的数量和规模锐减,多样性保存面临着严峻的挑战。此外,选育优良观赏性状的白皮松进行推广应用,亟需要开展种质鉴定和新品种权保护工作。然而,目前白皮松分子遗传学研究基础薄弱,特异性分子标记数量和类型匮乏,极大限制了白皮松群体遗传学研究与优良种质鉴定工作的进程。本研究利用SLAF-seq技术在白皮松全基因组范围内开发大量特异性SNP分子标记,基于这些高密度的SNP分子标记,对白皮松核心分布区内的4个代表性天然群体和1个人工群体进行遗传多样性、遗传结构和地理分化的分析,从分子水平对白皮松种质资源进行评价,并提出适宜的种质资源保存策略建议;此外,结合已发表的SSR引物和转录组测序自主开发的SSR引物,构建白皮松优良单株的SSR指纹图谱。为白皮松这一濒危树种种质资源的保护利用和良种选育工作提供科学依据。主要研究结果如下:(1)通过SLAF-seq技术,开发了全基因组水平分布的高质量SNP标记。经序列对比分析,共获得23,597,049个SLAF标签,其中具多态性的SLAF标签有370,659个,共开发得到1,291,290个白皮松群体SNP。在缺失率小于20%、次要等位基因频率大于5%的条件下,对所有SNP位点进行过滤,共得到346,840个高质量的白皮松群体SNP,占SNP总量的26.9%,其中包含9个仅在北京鹫峰(JF)群体中存在变异的SNP位点、4个仅在山西柏洼山(BWS)群体中存在变异的SNP位点、148个仅在陕西蓝田(LT)群体中存在变异的SNP位点、425个仅在甘肃麦积山(MJS)群体中存在变异的SNP位点、1466个仅在陕西午子山(WZS)群体中存在变异的SNP位点。(2)基于开发的SNP标记对白皮松群体遗传多样性的分析表明,白皮松群体遗传多样性水平在分布区内呈现出从西向东逐渐降低的趋势,其中MJS和WZS群体的遗传多样性水平相对较高,JF群体的遗传多样性水平相对较低。JF、MJS和LT群体中存在着一定程度的近交效应,导致群体中出现纯合子比例偏多,杂合子缺失的现象,但是近交程度很低。(3)基于开发的SNP标记对白皮松群体的遗传结构、主成分分析以及系统发育树分析的聚类结果一致表明,这52份白皮松种质资源可以划分为3个类群,其中来自东部和中部地区的JF、BWS和LT群体聚为一个类群,亲缘关系较近,而西部地区的MJS群体和WZS群体各聚为一个类群。对白皮松群体间遗传分化与地理隔离的分析表明,白皮松群体间分化系数Fst平均值为0.204±0.077,高于裸子植物天然居群分化的平均水平;Mantel检验结果显示,白皮松群体的遗传距离与地理隔离距离相关性显著,表明地理隔离效应是造成其群体间分化的重要因素。Tree Mix分析推断的最大似然树和潜在历史迁移事件表明,秦岭西部—大巴山脉与吕梁山脉的白皮松群体之间存在历史上的基因交流,并推测JF群体可能起源于来自陕西中西部地区少量个体的人工引种。(4)对白皮松进行转录组测序,并开发EST-SSR标记,从组装获得的23,194条Unigene序列中共检测到了2244个EST-SSR位点,成功设计了SSR引物619对,并从中随机合成76对引物,通过筛选得到了7对表现出较高多态性的引物。并从此前已发表的多态性SSR引物中筛选出了5对在54个白皮松优良单株中呈现较高多态性的引物。最终利用筛选出的共12对SSR引物构建出了白皮松优良单株SSR指纹图谱,可以将这54份优良种质全部区分开来,达到了精确鉴定的效果。(5)白皮松种质资源保存策略建议以原地保存为主,迁地保存为辅。原地保存,应重点保护西部地区现存规模较大且遗传多样性较高的群体,通过建立自然保护区或原地保存林等防止人为过度干扰和采伐,尽可能地维护原栖息地生境;迁地保存,应尽可能多地在不同地区的不同群体中收集种质,同时还应在遗传多样性较高的地区进行重点采样,并对异地保存林开展动态检测、持续抚育以及病虫害防治等保护工作。

白皮松种质资源评价及优良单株指纹图谱构建

这是一篇关于白皮松,SNP标记,群体遗传学,EST-SSR,指纹图谱的论文, 主要内容为白皮松是中国特有的濒危树种,目前白皮松的生境已遭到非常严重的片段化威胁,一些独特或稀有的基因存在丢失风险,加之其天然群体的更新较为困难,其长期的进化和正常的演化进程受到阻碍,分布区内许多天然群体的数量和规模锐减,多样性保存面临着严峻的挑战。此外,选育优良观赏性状的白皮松进行推广应用,亟需要开展种质鉴定和新品种权保护工作。然而,目前白皮松分子遗传学研究基础薄弱,特异性分子标记数量和类型匮乏,极大限制了白皮松群体遗传学研究与优良种质鉴定工作的进程。本研究利用SLAF-seq技术在白皮松全基因组范围内开发大量特异性SNP分子标记,基于这些高密度的SNP分子标记,对白皮松核心分布区内的4个代表性天然群体和1个人工群体进行遗传多样性、遗传结构和地理分化的分析,从分子水平对白皮松种质资源进行评价,并提出适宜的种质资源保存策略建议;此外,结合已发表的SSR引物和转录组测序自主开发的SSR引物,构建白皮松优良单株的SSR指纹图谱。为白皮松这一濒危树种种质资源的保护利用和良种选育工作提供科学依据。主要研究结果如下:(1)通过SLAF-seq技术,开发了全基因组水平分布的高质量SNP标记。经序列对比分析,共获得23,597,049个SLAF标签,其中具多态性的SLAF标签有370,659个,共开发得到1,291,290个白皮松群体SNP。在缺失率小于20%、次要等位基因频率大于5%的条件下,对所有SNP位点进行过滤,共得到346,840个高质量的白皮松群体SNP,占SNP总量的26.9%,其中包含9个仅在北京鹫峰(JF)群体中存在变异的SNP位点、4个仅在山西柏洼山(BWS)群体中存在变异的SNP位点、148个仅在陕西蓝田(LT)群体中存在变异的SNP位点、425个仅在甘肃麦积山(MJS)群体中存在变异的SNP位点、1466个仅在陕西午子山(WZS)群体中存在变异的SNP位点。(2)基于开发的SNP标记对白皮松群体遗传多样性的分析表明,白皮松群体遗传多样性水平在分布区内呈现出从西向东逐渐降低的趋势,其中MJS和WZS群体的遗传多样性水平相对较高,JF群体的遗传多样性水平相对较低。JF、MJS和LT群体中存在着一定程度的近交效应,导致群体中出现纯合子比例偏多,杂合子缺失的现象,但是近交程度很低。(3)基于开发的SNP标记对白皮松群体的遗传结构、主成分分析以及系统发育树分析的聚类结果一致表明,这52份白皮松种质资源可以划分为3个类群,其中来自东部和中部地区的JF、BWS和LT群体聚为一个类群,亲缘关系较近,而西部地区的MJS群体和WZS群体各聚为一个类群。对白皮松群体间遗传分化与地理隔离的分析表明,白皮松群体间分化系数Fst平均值为0.204±0.077,高于裸子植物天然居群分化的平均水平;Mantel检验结果显示,白皮松群体的遗传距离与地理隔离距离相关性显著,表明地理隔离效应是造成其群体间分化的重要因素。Tree Mix分析推断的最大似然树和潜在历史迁移事件表明,秦岭西部—大巴山脉与吕梁山脉的白皮松群体之间存在历史上的基因交流,并推测JF群体可能起源于来自陕西中西部地区少量个体的人工引种。(4)对白皮松进行转录组测序,并开发EST-SSR标记,从组装获得的23,194条Unigene序列中共检测到了2244个EST-SSR位点,成功设计了SSR引物619对,并从中随机合成76对引物,通过筛选得到了7对表现出较高多态性的引物。并从此前已发表的多态性SSR引物中筛选出了5对在54个白皮松优良单株中呈现较高多态性的引物。最终利用筛选出的共12对SSR引物构建出了白皮松优良单株SSR指纹图谱,可以将这54份优良种质全部区分开来,达到了精确鉴定的效果。(5)白皮松种质资源保存策略建议以原地保存为主,迁地保存为辅。原地保存,应重点保护西部地区现存规模较大且遗传多样性较高的群体,通过建立自然保护区或原地保存林等防止人为过度干扰和采伐,尽可能地维护原栖息地生境;迁地保存,应尽可能多地在不同地区的不同群体中收集种质,同时还应在遗传多样性较高的地区进行重点采样,并对异地保存林开展动态检测、持续抚育以及病虫害防治等保护工作。

白皮松种质资源评价及优良单株指纹图谱构建

这是一篇关于白皮松,SNP标记,群体遗传学,EST-SSR,指纹图谱的论文, 主要内容为白皮松是中国特有的濒危树种,目前白皮松的生境已遭到非常严重的片段化威胁,一些独特或稀有的基因存在丢失风险,加之其天然群体的更新较为困难,其长期的进化和正常的演化进程受到阻碍,分布区内许多天然群体的数量和规模锐减,多样性保存面临着严峻的挑战。此外,选育优良观赏性状的白皮松进行推广应用,亟需要开展种质鉴定和新品种权保护工作。然而,目前白皮松分子遗传学研究基础薄弱,特异性分子标记数量和类型匮乏,极大限制了白皮松群体遗传学研究与优良种质鉴定工作的进程。本研究利用SLAF-seq技术在白皮松全基因组范围内开发大量特异性SNP分子标记,基于这些高密度的SNP分子标记,对白皮松核心分布区内的4个代表性天然群体和1个人工群体进行遗传多样性、遗传结构和地理分化的分析,从分子水平对白皮松种质资源进行评价,并提出适宜的种质资源保存策略建议;此外,结合已发表的SSR引物和转录组测序自主开发的SSR引物,构建白皮松优良单株的SSR指纹图谱。为白皮松这一濒危树种种质资源的保护利用和良种选育工作提供科学依据。主要研究结果如下:(1)通过SLAF-seq技术,开发了全基因组水平分布的高质量SNP标记。经序列对比分析,共获得23,597,049个SLAF标签,其中具多态性的SLAF标签有370,659个,共开发得到1,291,290个白皮松群体SNP。在缺失率小于20%、次要等位基因频率大于5%的条件下,对所有SNP位点进行过滤,共得到346,840个高质量的白皮松群体SNP,占SNP总量的26.9%,其中包含9个仅在北京鹫峰(JF)群体中存在变异的SNP位点、4个仅在山西柏洼山(BWS)群体中存在变异的SNP位点、148个仅在陕西蓝田(LT)群体中存在变异的SNP位点、425个仅在甘肃麦积山(MJS)群体中存在变异的SNP位点、1466个仅在陕西午子山(WZS)群体中存在变异的SNP位点。(2)基于开发的SNP标记对白皮松群体遗传多样性的分析表明,白皮松群体遗传多样性水平在分布区内呈现出从西向东逐渐降低的趋势,其中MJS和WZS群体的遗传多样性水平相对较高,JF群体的遗传多样性水平相对较低。JF、MJS和LT群体中存在着一定程度的近交效应,导致群体中出现纯合子比例偏多,杂合子缺失的现象,但是近交程度很低。(3)基于开发的SNP标记对白皮松群体的遗传结构、主成分分析以及系统发育树分析的聚类结果一致表明,这52份白皮松种质资源可以划分为3个类群,其中来自东部和中部地区的JF、BWS和LT群体聚为一个类群,亲缘关系较近,而西部地区的MJS群体和WZS群体各聚为一个类群。对白皮松群体间遗传分化与地理隔离的分析表明,白皮松群体间分化系数Fst平均值为0.204±0.077,高于裸子植物天然居群分化的平均水平;Mantel检验结果显示,白皮松群体的遗传距离与地理隔离距离相关性显著,表明地理隔离效应是造成其群体间分化的重要因素。Tree Mix分析推断的最大似然树和潜在历史迁移事件表明,秦岭西部—大巴山脉与吕梁山脉的白皮松群体之间存在历史上的基因交流,并推测JF群体可能起源于来自陕西中西部地区少量个体的人工引种。(4)对白皮松进行转录组测序,并开发EST-SSR标记,从组装获得的23,194条Unigene序列中共检测到了2244个EST-SSR位点,成功设计了SSR引物619对,并从中随机合成76对引物,通过筛选得到了7对表现出较高多态性的引物。并从此前已发表的多态性SSR引物中筛选出了5对在54个白皮松优良单株中呈现较高多态性的引物。最终利用筛选出的共12对SSR引物构建出了白皮松优良单株SSR指纹图谱,可以将这54份优良种质全部区分开来,达到了精确鉴定的效果。(5)白皮松种质资源保存策略建议以原地保存为主,迁地保存为辅。原地保存,应重点保护西部地区现存规模较大且遗传多样性较高的群体,通过建立自然保护区或原地保存林等防止人为过度干扰和采伐,尽可能地维护原栖息地生境;迁地保存,应尽可能多地在不同地区的不同群体中收集种质,同时还应在遗传多样性较高的地区进行重点采样,并对异地保存林开展动态检测、持续抚育以及病虫害防治等保护工作。

沙棘叶清炒工艺及其谱效关系研究

这是一篇关于沙棘叶,炮制工艺,黄酮,指纹图谱,谱效关系的论文, 主要内容为沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)为胡颓子科沙棘属的一种多刺固氮落叶灌木。沙棘叶的活性成分占沙棘全株的70%左右,其中黄酮含量更是高于沙棘果,具有很高的开发应用价值。但目前沙棘叶在沙棘资源的开发中常被当成废弃物处理,造成一定的资源浪费。目前对沙棘叶的研究多聚焦于其冲泡茶以及成分分析,并未有对沙棘叶进行炮制的先例。基于这种背景,且为了提高沙棘副产物的综合利用,本课题对沙棘叶进行炮制工艺优化,并以此为基础进行一系列的研究,旨在为沙棘叶的进一步开发利用提供可靠依据,主要研究方法与结果如下:1.沙棘叶炮制工艺优化及质量标准研究:采用清炒法中炒黄法进行实验,以总黄酮含量作为指标,进行单因素实验,筛选出炒制时间、炒制温度及炒制量,再经响应面实验设计优化最优清炒工艺,得出最优清炒工艺为:炒制时间3±0.5 min,炒制温度140±5℃,炒制量为炒药机容积的1/3-1/4。在最佳炮制工艺条件下,沙棘叶总黄酮含量为2.92%。炒沙棘叶各个指标均符合《四川省藏药材标准》(2014年版)中沙棘叶质量标准的规定,并在此基础上起草了炒沙棘叶的质量标准。2.清炒对沙棘叶性质及生物活性的影响规律:采用扫描电镜、红外光谱和高效液相色谱法对比了清炒前后沙棘叶外观形态和化学组成的变化,探究了清炒前后沙棘叶粗黄酮的部分生物活性。扫描电镜结果表明清炒改变了沙棘叶的微观形貌。红外光谱结果表明清炒未改变沙棘叶中有效成分的结构,但使其整体含量增加。液相色谱结果表明沙棘叶纯化黄酮含有芦丁、鞣花酸、异槲皮苷这三种单体化合物,其中生品中芦丁的含量为10.36μg/m L,炮制品中芦丁的含量为11.79μg/m L。体外生物活性实验结果表明生品沙棘叶粗黄酮及炒沙棘叶粗黄酮均具有较强的抗氧化活性、降糖活性和抗凝血活性。沙棘叶粗黄酮和炒沙棘叶粗黄酮对DPPH自由基的IC50分别为13.42±0.3μg/m L和10.92±0.2μg/m L,对羟基自由基的IC50分别为0.27±0.01mg/m L和0.23±0.01 mg/m L,对α-葡萄糖苷酶的IC50分别5.25±0.20μg/m L和3.54±0.20μg/m L,高浓度沙棘叶及炒沙棘叶粗黄酮均使PT、TT和APTT值逐渐延长从而发挥抗凝作用,剂量与活性之间存在一定的依赖关系(P<0.05)。3.清炒前后沙棘叶纯化黄酮指纹图谱及抗氧化谱效关系:采用高效液相色谱仪建立了10批不同产地不同批次沙棘叶清炒前后的HPLC指纹图谱,利用灰色关联度法和Pearson相关性分析法进行炒沙棘叶纯化黄酮指纹图谱-抗氧化谱效关系的研究。结果表明20个黄酮指纹图谱共指认了12个共有峰,相似度在0.813～0.993,表明其成分的一致性,但含量具有一定的差异性。聚类分析将10批沙棘叶及其炒制品聚为两大类。主成分分析降维提取了3个主成分,反映了原来变量85.955%的信息并得到峰12是对差异贡献最大的成分。灰色关联度结果表明10批炒沙棘叶纯化黄酮12个共有峰中有7个与抗氧化作用具有较大关联,对抗氧化活性贡献最大的为峰10(异槲皮苷),其关联度为0.771。Pearson相关系数大于0.400的共有峰存在3个,对抗氧化活性有价值的共有峰为峰10,且相关性水平显著(P<0.01),这与灰色关联度分析得到的结果相对应。4.基于超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法和网络药理学探讨炒沙棘叶纯化黄酮抗氧化作用机制:采用质谱分析炒沙棘叶黄酮化学成分,采用网络药理学通过多成分、多靶点、多通路角度探索了炒沙棘叶纯化黄酮发挥抗氧化活性的作用机制。结果为质谱解析得到了炒沙棘叶纯化黄酮11种单体化合物,通过网络药理学分析得到炒沙棘叶纯化黄酮通过92条通路,涉及到644个生物学过程,61个细胞组成,56个分子功能,并主要作用于5个靶点蛋白而发挥抗氧化活性。本课题优化的沙棘叶清炒工艺能够提升沙棘叶有效成分含量,提高其抗氧化、降糖、抗凝血等生物活性,HPLC指纹图谱抗氧化谱效关系研究能客观地反映不同产地沙棘叶质量的差异,研究结果将为沙棘叶质量评价及开发利用提供理论基础和重要依据,对沙棘叶资源开发及产业化具有一定的价值。

沙棘叶清炒工艺及其谱效关系研究

这是一篇关于沙棘叶,炮制工艺,黄酮,指纹图谱,谱效关系的论文, 主要内容为沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)为胡颓子科沙棘属的一种多刺固氮落叶灌木。沙棘叶的活性成分占沙棘全株的70%左右,其中黄酮含量更是高于沙棘果,具有很高的开发应用价值。但目前沙棘叶在沙棘资源的开发中常被当成废弃物处理,造成一定的资源浪费。目前对沙棘叶的研究多聚焦于其冲泡茶以及成分分析,并未有对沙棘叶进行炮制的先例。基于这种背景,且为了提高沙棘副产物的综合利用,本课题对沙棘叶进行炮制工艺优化,并以此为基础进行一系列的研究,旨在为沙棘叶的进一步开发利用提供可靠依据,主要研究方法与结果如下:1.沙棘叶炮制工艺优化及质量标准研究:采用清炒法中炒黄法进行实验,以总黄酮含量作为指标,进行单因素实验,筛选出炒制时间、炒制温度及炒制量,再经响应面实验设计优化最优清炒工艺,得出最优清炒工艺为:炒制时间3±0.5 min,炒制温度140±5℃,炒制量为炒药机容积的1/3-1/4。在最佳炮制工艺条件下,沙棘叶总黄酮含量为2.92%。炒沙棘叶各个指标均符合《四川省藏药材标准》(2014年版)中沙棘叶质量标准的规定,并在此基础上起草了炒沙棘叶的质量标准。2.清炒对沙棘叶性质及生物活性的影响规律:采用扫描电镜、红外光谱和高效液相色谱法对比了清炒前后沙棘叶外观形态和化学组成的变化,探究了清炒前后沙棘叶粗黄酮的部分生物活性。扫描电镜结果表明清炒改变了沙棘叶的微观形貌。红外光谱结果表明清炒未改变沙棘叶中有效成分的结构,但使其整体含量增加。液相色谱结果表明沙棘叶纯化黄酮含有芦丁、鞣花酸、异槲皮苷这三种单体化合物,其中生品中芦丁的含量为10.36μg/m L,炮制品中芦丁的含量为11.79μg/m L。体外生物活性实验结果表明生品沙棘叶粗黄酮及炒沙棘叶粗黄酮均具有较强的抗氧化活性、降糖活性和抗凝血活性。沙棘叶粗黄酮和炒沙棘叶粗黄酮对DPPH自由基的IC50分别为13.42±0.3μg/m L和10.92±0.2μg/m L,对羟基自由基的IC50分别为0.27±0.01mg/m L和0.23±0.01 mg/m L,对α-葡萄糖苷酶的IC50分别5.25±0.20μg/m L和3.54±0.20μg/m L,高浓度沙棘叶及炒沙棘叶粗黄酮均使PT、TT和APTT值逐渐延长从而发挥抗凝作用,剂量与活性之间存在一定的依赖关系(P<0.05)。3.清炒前后沙棘叶纯化黄酮指纹图谱及抗氧化谱效关系:采用高效液相色谱仪建立了10批不同产地不同批次沙棘叶清炒前后的HPLC指纹图谱,利用灰色关联度法和Pearson相关性分析法进行炒沙棘叶纯化黄酮指纹图谱-抗氧化谱效关系的研究。结果表明20个黄酮指纹图谱共指认了12个共有峰,相似度在0.813～0.993,表明其成分的一致性,但含量具有一定的差异性。聚类分析将10批沙棘叶及其炒制品聚为两大类。主成分分析降维提取了3个主成分,反映了原来变量85.955%的信息并得到峰12是对差异贡献最大的成分。灰色关联度结果表明10批炒沙棘叶纯化黄酮12个共有峰中有7个与抗氧化作用具有较大关联,对抗氧化活性贡献最大的为峰10(异槲皮苷),其关联度为0.771。Pearson相关系数大于0.400的共有峰存在3个,对抗氧化活性有价值的共有峰为峰10,且相关性水平显著(P<0.01),这与灰色关联度分析得到的结果相对应。4.基于超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法和网络药理学探讨炒沙棘叶纯化黄酮抗氧化作用机制:采用质谱分析炒沙棘叶黄酮化学成分,采用网络药理学通过多成分、多靶点、多通路角度探索了炒沙棘叶纯化黄酮发挥抗氧化活性的作用机制。结果为质谱解析得到了炒沙棘叶纯化黄酮11种单体化合物,通过网络药理学分析得到炒沙棘叶纯化黄酮通过92条通路,涉及到644个生物学过程,61个细胞组成,56个分子功能,并主要作用于5个靶点蛋白而发挥抗氧化活性。本课题优化的沙棘叶清炒工艺能够提升沙棘叶有效成分含量,提高其抗氧化、降糖、抗凝血等生物活性,HPLC指纹图谱抗氧化谱效关系研究能客观地反映不同产地沙棘叶质量的差异,研究结果将为沙棘叶质量评价及开发利用提供理论基础和重要依据,对沙棘叶资源开发及产业化具有一定的价值。