基于SSR分子标记的紫薇属亲缘关系及遗传多样性分析

这是一篇关于紫薇,遗传多样性,亲缘关系,SSR,分子标记,DNA指纹图谱的论文, 主要内容为紫薇(Lagerstroemia indica)隶属于千屈菜科(Lythraceae)紫薇属(Lagerstroemia),为多年生落叶灌木或小乔木,栽培历史悠久,具有花色丰富、艳丽、花期长、抗污染等优点深受大家喜欢,在园林景观、绿化工作中被大量应用。随着紫薇新品种越来越多,存在品种管理混乱、品种鉴定困难等,严重阻碍了紫薇产业的发展。本研究根据紫薇叶片转录组数据对紫薇SSR位点进行分析,设计并筛选了适合紫薇SSR分析的引物,评价了 97个紫薇品种(种)的亲缘关系和遗传多样性,构建了其指纹图谱,为紫薇品种(种)鉴定和保护提供了科学依据。本研究具体研究结果如下:(1)对紫薇品种‘Dynamite’和‘Ebony Embers’的幼叶和成熟叶进行转录组测序,从长度大于500 bp的44,440个转录本中发现包含SSR位点的转录本数量12,901个,占29.03%。共检测出SSR位点数量为15,275个,其中完全重复形式(P型)的SSR位点共13,844个,占90.63%,复合重复单元(C型)的SSR共有1,431个,占9.37%。P型SSR位点中,单核苷酸重复型(P1型)、双核甘酸重复型(P2型)和三核苷酸重复型(P3型)的SSR位点最丰富,占88.58%。(2)根据转录本序列信息成功设计出12,882对SSR引物,引物设计成功率为84.33%。从随机挑选的300对引物中筛选出24对扩增条带清晰、多态性和稳定性好的引物。24对SSR引物对97份紫薇品种(种)进行SSR-PCR扩增,共检测到535个扩增位点,引物多态性位点百分比达到100%,Shannon信息指数(I)在0.059～3.774之间,观测杂合度(Ho)在0～0.584之间,期望杂合度(He)在0.021～0.972之间,其中有24对引物的期望杂合度(He)高于观测杂合度(Ho),占比100%%,基因多样性指数(G)在0.08～0.971之间,多态信息含量(PIC)在0.078～0.970之间,平均值为0.586。说明利用筛选获得24对SSR引物均能对97个紫薇品种进行很好的扩增,为紫薇品种鉴定、亲缘关系分析和遗传多样性研究提供了合适的引物。(3)对97个紫薇品种(种)进行亲缘关系分析发现,97个紫薇品种(种)被聚为9个类群。7个紫薇野生种中,毛萼紫薇、福建紫薇、小花紫薇、大花紫薇、川黔紫薇聚类在类群Ⅰ中,尾叶紫薇和屋久岛紫薇聚集在类群Ⅶ中,聚类结果即表明这些紫薇野生种在进化中处于较原始地位,在紫薇长期杂交育种工作中,野生种做为亲本广泛参与了紫薇新品种培育过程。97个紫薇品种(种)中,来自美国佛罗里达州的紫薇品种在9个类群中均有聚集,与美国在紫薇新品种开发利用方面研究起步早,从全球收集了许多紫薇资源,并开展了大量的杂交育种实验,培育出了许多植物新品种有关。(4)9个类群97个紫薇品种(种)总的近交系数(Fit)为0.841,群体近交系数(Fis)为0.832,遗传分化系数(Fst)为0.054,基因流(Nm)为4.362,紫薇9个类群的遗传分化非常低,基因流和群体的遗传稳定性非常高。AMOVE分析显示9个紫薇类群的遗传变异主要来源于类群内部,变异系数为7.751,占总变异的79%,而类群之间的变异最低仅占5%。可能与紫薇的新品种培育方式有关,人为的杂交育种加强了紫薇品种(种)间的基因交流,是导致紫薇品种(种)间遗传分化低的主要原因。(5)对多态性最好的15对引物的鉴别能力进行评价,引物SSR292的鉴别能力最强,共鉴别紫薇品种(种)58个,引物SSR132、SSR174和SSR102次之,引物SSR293和SSR269的鉴别数量最少。采用引物组合法,以最少引物组合,且鉴别能力最大为原则,获得了成功鉴别出97个紫薇品种(种)的核心引物 6 个,即 SSR292、SSR132、SSR102、SSR289、SSR107 和 SSR211。利用核心引物成功构建了 97个紫薇品种(种)的DNA指纹图谱,并转换为指纹二维码,首次建立包含品种较为全面的紫薇DNA分子身份证,为建立紫薇标准指纹库平台奠定基础,也为紫薇品种(种)鉴定和保护提供了科学依据。

基于SSR分子标记的紫薇属亲缘关系及遗传多样性分析

这是一篇关于紫薇,遗传多样性,亲缘关系,SSR,分子标记,DNA指纹图谱的论文, 主要内容为紫薇(Lagerstroemia indica)隶属于千屈菜科(Lythraceae)紫薇属(Lagerstroemia),为多年生落叶灌木或小乔木,栽培历史悠久,具有花色丰富、艳丽、花期长、抗污染等优点深受大家喜欢,在园林景观、绿化工作中被大量应用。随着紫薇新品种越来越多,存在品种管理混乱、品种鉴定困难等,严重阻碍了紫薇产业的发展。本研究根据紫薇叶片转录组数据对紫薇SSR位点进行分析,设计并筛选了适合紫薇SSR分析的引物,评价了 97个紫薇品种(种)的亲缘关系和遗传多样性,构建了其指纹图谱,为紫薇品种(种)鉴定和保护提供了科学依据。本研究具体研究结果如下:(1)对紫薇品种‘Dynamite’和‘Ebony Embers’的幼叶和成熟叶进行转录组测序,从长度大于500 bp的44,440个转录本中发现包含SSR位点的转录本数量12,901个,占29.03%。共检测出SSR位点数量为15,275个,其中完全重复形式(P型)的SSR位点共13,844个,占90.63%,复合重复单元(C型)的SSR共有1,431个,占9.37%。P型SSR位点中,单核苷酸重复型(P1型)、双核甘酸重复型(P2型)和三核苷酸重复型(P3型)的SSR位点最丰富,占88.58%。(2)根据转录本序列信息成功设计出12,882对SSR引物,引物设计成功率为84.33%。从随机挑选的300对引物中筛选出24对扩增条带清晰、多态性和稳定性好的引物。24对SSR引物对97份紫薇品种(种)进行SSR-PCR扩增,共检测到535个扩增位点,引物多态性位点百分比达到100%,Shannon信息指数(I)在0.059～3.774之间,观测杂合度(Ho)在0～0.584之间,期望杂合度(He)在0.021～0.972之间,其中有24对引物的期望杂合度(He)高于观测杂合度(Ho),占比100%%,基因多样性指数(G)在0.08～0.971之间,多态信息含量(PIC)在0.078～0.970之间,平均值为0.586。说明利用筛选获得24对SSR引物均能对97个紫薇品种进行很好的扩增,为紫薇品种鉴定、亲缘关系分析和遗传多样性研究提供了合适的引物。(3)对97个紫薇品种(种)进行亲缘关系分析发现,97个紫薇品种(种)被聚为9个类群。7个紫薇野生种中,毛萼紫薇、福建紫薇、小花紫薇、大花紫薇、川黔紫薇聚类在类群Ⅰ中,尾叶紫薇和屋久岛紫薇聚集在类群Ⅶ中,聚类结果即表明这些紫薇野生种在进化中处于较原始地位,在紫薇长期杂交育种工作中,野生种做为亲本广泛参与了紫薇新品种培育过程。97个紫薇品种(种)中,来自美国佛罗里达州的紫薇品种在9个类群中均有聚集,与美国在紫薇新品种开发利用方面研究起步早,从全球收集了许多紫薇资源,并开展了大量的杂交育种实验,培育出了许多植物新品种有关。(4)9个类群97个紫薇品种(种)总的近交系数(Fit)为0.841,群体近交系数(Fis)为0.832,遗传分化系数(Fst)为0.054,基因流(Nm)为4.362,紫薇9个类群的遗传分化非常低,基因流和群体的遗传稳定性非常高。AMOVE分析显示9个紫薇类群的遗传变异主要来源于类群内部,变异系数为7.751,占总变异的79%,而类群之间的变异最低仅占5%。可能与紫薇的新品种培育方式有关,人为的杂交育种加强了紫薇品种(种)间的基因交流,是导致紫薇品种(种)间遗传分化低的主要原因。(5)对多态性最好的15对引物的鉴别能力进行评价,引物SSR292的鉴别能力最强,共鉴别紫薇品种(种)58个,引物SSR132、SSR174和SSR102次之,引物SSR293和SSR269的鉴别数量最少。采用引物组合法,以最少引物组合,且鉴别能力最大为原则,获得了成功鉴别出97个紫薇品种(种)的核心引物 6 个,即 SSR292、SSR132、SSR102、SSR289、SSR107 和 SSR211。利用核心引物成功构建了 97个紫薇品种(种)的DNA指纹图谱,并转换为指纹二维码,首次建立包含品种较为全面的紫薇DNA分子身份证,为建立紫薇标准指纹库平台奠定基础,也为紫薇品种(种)鉴定和保护提供了科学依据。

太行花种群遗传多样性与分子谱系地理学研究

这是一篇关于太行花,SSR,叶绿体DNA,谱系地理学,群体遗传结构,保护策略的论文, 主要内容为太行花(Taihangia rupestris Yu et Li)是蔷薇科仙女木族最原始的二倍体草本植物,染色体2n=l4,属古老的残遗种。花的结构由两性花向单性花演变,这在仙女木族进化上占有特殊的位置,对阐明蔷薇科一些类群的起源和演化问题具有重要意义。采用核基因组SSR标记研究太行花的遗传多样性和遗传结构,通过叶绿体DNA多片段序列变异探讨太行花物种和群体的动态历史,为揭示太行花的濒危机制和制定适宜的保护策略提供理论基础。主要研究结果如下:(1)用10对微卫星引物对10个种群224个体进行检测分型。分析表明,太行花种群有较高的遗传多样性(0.773),大部分的遗传变异存在于种群内(81.49%),群体间有很小程度的遗传分化(FST=0.1792,GST=0.177),种群间的基因流Nm=1.0536。(2)UPGMA聚类将太行花10个种群分为两个组。其中南部种群(DPB,YDS,LHP,QPG,XXT,HHS)聚为一组,北部4个种群聚为另一组。Structure分析揭示的结果与UPGMA聚类完全相同,北部群体和南部群体各有自己的祖先来源。(3)Mantel检验结果显示种群间的遗传距离和地理距离之间有显著的相关性(r=0.597,P<0.001),说明地理因素对太行花的群体遗传结构有较大的影响。(4)瓶颈效应检测发现,在TPM和SMM模型下,均显示有7个种群(DPB,YDS,LHP,QPG,JG,NY,DLG)经历了瓶颈效应。(5)从20对叶绿体片段中筛选出4个适合太行花群体遗传分析的片段,对太行花10个群体共220个个体进行检测分析。太行花物种水平的单倍型多态性(Hd)为0.729,核苷酸多态性(π)为1.37×10-3。太行花总的遗传多样性较高(HT=0.803),但居群内遗传多样性较低(HS=0.017)。AMOVA分析表明分布区内太行花的遗传变异主要存在于种群间(90.72%),种群间遗传分化很高(GST=0.979,FST=0.995,NST=0.996)没有明显的谱系地理学结构且种群间平均基因流(Nm=0.01)很低。(6)叶绿体4个片段的变异位点组合成了7个单倍型,单倍型的系统进化树和进化分支网络分析得到了相似的拓扑结构,7种单倍型聚为3个分枝,分枝1包含在南部和北部地区的6个种群出现的单倍型,南部地区的3个种群中出现的单倍型组成分枝2,分枝3只有北部地区1个种群所含的单倍型。

基于苋菜转录组测序的SSR和SNP分子标记开发

这是一篇关于苋菜,转录组,SSR,SNP,引物开发的论文, 主要内容为苋菜属于石竹目苋科苋属(Amaranthus L.),其种质资源丰富,在世界很多国家都有种植,是一种具有营养价值和药用价值的作物,作为21世纪粮食、蔬菜、健康食品和饲料的资源植物被广泛关注。苋菜资源丰富,在现有的苋属植物的分类中,还没有适合苋菜SSR和SNP特异标记引物。本研究利用实验室的苋菜转录组数据库,自主开发SSR和SNP标记引物,利用本研究开发的SSR分子标记对三色苋(Amaranthus tricolour L.)的180份苋菜材料进行品种鉴定及遗传多样性分析,同时对其亲缘关系进行系统分类;结合HRM技术,首次利用SNP分子标记引物进行基因分型,以期为苋菜育种及栽培奠定基础,开发苋菜资源,提高其利用价值,也为苋菜品种登记审定、品种权保护,及控制入侵种类提供参考依据和技术支持。具体研究结果如下:1.苋菜SSR位点分析基于实验室构建的苋菜高通量转录组数据库(SRA number:SRR924089,SSR924090,SRR924091,SRR924092),利用MISA软件进行SSR位点的搜索。在苋菜转录组总共检测到5251个SSR位点,SSR序列主要以三核苷酸为基序,其次为二核苷酸为基序,数量分别为2499和1030,各占47.59%和19.62%;二核苷酸基序中以AG/CT最多,共554条,约占二核苷酸基序的53.79%,其次为AT/AT,共304条,约占二核苷酸基序的29.51%,CG/CG占比最少,只有2条,约占二核苷酸基序的0.19%。三核苷酸基序中以ATC/ATG最多,共810条,约占三核苷酸基序的32.41%,其次为AAG/CTT,共523条,约占三核苷酸基序的20.93%,ACG/CGT占比最少,数量为14条,约占三核苷酸基序的0.56%;SSR长度为15 bp的出现次数最多,共1307次;其次为18 bp和21bp,分别是706次和808次。另外,本文还依据搜索出的SSRs设计了49对引物。由此可看出,SSR位点出现的频率较高,用于开发苋菜EST-SSR标记是可行的。2.苋菜SSR体系优化在PCR扩增反应条件基础上,选取DNA模板、Taq酶、Primer、dNTP、Mg2+为5个试验因素,采用正交设计L25(56)对反应体系进行了优化,最佳体系为:20ng/μL DNA模版1μL,10μmol/μL引物为1.25 μL,2.5 mmol/LdNTP 为 1 μL,25 mmol/LMg2+为 1 μL,5U/μLTaq酶为 0.3μL,10×Buffer(1.5mM)2.5μL,H2O 17.95μL。在本研究中发现:利用 Dream Taq Green MM(Thermo Scientific)PCR 扩增预混试剂与最佳PCR扩增体系效果一致,条带亮度相似且清晰,无拖带,可以用于后续试验。3.180份苋菜种质资源多态性的SSR分析根据苋菜EST-SSR标记位点分析结果,利用Primer Premier5软件在SSRs侧翼序列设计引物,共设计49对引物。然后利用最佳扩增体系,选择3份苋菜供试材料对SSR引物进行初步筛选,共筛选出了具特异性、条带清晰、无拖带等有效引物17条;再将180份苋菜种质资源进行PCR扩增,用琼脂糖进行检测,筛选到13对可用引物。同时,将这13对引物扩增的SSR-PCR产物使用15%Native-PAGE胶检测,最终获得具有高多态性EST-SSR引物。4.180份苋菜种质资源的SSR与ISSR分析比较本研究分别利用EST-SSR与ISSR对.180份苋菜种质资源进行了亲缘关系的研究。苋菜EST-SSR开发得到的引物,对供试的180份苋菜种质资源扩增条带共得到145个多态性位点,谱带的分布范围很广,为3～29,每条引物平均多态性位点数为11.15,多态性扩增效果高。苋菜ISSR分子标记选用的13条UBC引物,其扩增条带共得到121个谱带,谱带范围为5-12,每条引物平均多态性位点数为9.3,UBC引物多态性较SSR特异性引物多态性少。电泳结果表明SSR特异性引物比ISSR通用UBC引物能更加高效的结合到样品DNA中,因此,苋菜SSR标记所开发的特异引物较ISSR标记的通用引物效果更好、成功率更高,对苋菜EST-SSR特异性标记引物的研究,将有利于苋菜种质资源的鉴定。基于苋菜SSR标记的聚类结果分析,180份供试苋菜种质资源能够被有效的进行聚类,聚类结果为2大类,16类种群。其中,不同地区来源的种质被聚类到一起,表明这些种类遗传背景相似;而有些相同地区来源的种质被聚类为不同类型,该结果说明,同地区的苋菜种质中,仍然存在遗传多态性,不同品种间具有遗传差异。与ISSR标记聚类结果相比较发现,ISSR标记将180份供试苋菜种质资源聚类结果为2大类,11类种群,大体上与SSR聚类结果相近,表明SSR标记与ISSR标记均能够揭示苋菜种质资源遗传信息的共性与差异性。对扩增效果与聚类结果进行结合分析,认为苋菜SSR分子标记开发,具有效率好、可信度高的特点,可以利用此标记进行苋菜种质亲缘关系分析。5.180份苋菜种质资源的SNP位点分析本研究首次利用苋菜转录组数据进行了 SNP位点分析,利用RNA-Seq比对软件STAR对每个样本的Reads与Unigene进行比对,并通过GATK针对RNA-Seq的SNP识别流程,识别SNP位点。共筛选到15422个SNP位点,数据量较大。苋菜SNP位点分析发现,杂合型位点数量多于纯合型,这可能也和苋菜资源丰富有关,由于本研究收集的材料比较多,苋菜叶片上有红叶、绿叶和花叶,在遗传背景比较复杂,所以在引物筛选过程中会导致效率偏低,只有25%。通过基因测序及比对分析,我们得到1条含有SNP位点的基因是与叶绿素ab结合蛋白相关,由于红苋菜或花苋菜中含有甜菜红素,从而会影响到植株光合作用能力。而该基因存在SNP位点,可能与红苋菜(红叶或者红茎)、绿苋菜与花苋菜(红叶绿茎、红茎绿叶或者叶片半红半绿)的光合能力不同有关。

基于全长转录组的福建多花黄精SSR分子标记开发与应用

这是一篇关于多花黄精,SSR,ISSR,形态学标记,遗传多样性的论文, 主要内容为多花黄精是百合科黄精属的植物,也是集观赏价值和药用价值于一体的植物,具有很高的经济价值,市场需求量日益扩增。为了满足市场需求,除野生多花黄精,人工栽培的多花黄精也日益增加。多花黄精种质资源丰富,但目前面临着黄精属植物品种繁多,各地引种栽培的种质的来源信息混乱,导致分类非常困难地问题。本试验收集了福建省内黄精资源305份,并基于形态学标记对收集的材料进行表型特征观测及分类;同时对福建多花黄精进行测序,并对测序获得的多花黄精全长转录组数据进行SSR引物的开发、全长转录组核心位点的测序分析及ISSR分子标记验证,并将SSR、ISSR、形态学标记这3种标记的分类结果进行比较分析,为研究多花黄精遗传多样性、多花黄精品种的鉴别及其它研究提供参考依据。主要研究结果如下:1基于形态学标记的福建多花黄精遗传多样性分析本试验收集了福建省内黄精种质305份,其中80份来源于邵武市、77份来源于龙岩市、75份来源于三明市、38份来源于宁德市及35份来源于泉州市,对福建省内黄精资源的9个质量性状和10个数量性状进行分析,探究福建黄精种质的遗传多样性。研究结果表明:9个质量性状平均遗传多样性为0.795,遗传多样性指数的大小排序为:叶片形状>根茎形状>叶片和茎秆颜色>花被色>果实颜色>叶序>根茎颜色>花序>果实类型。10个数量性状变异系数在27.17%-89.05%之间,平均值为52.772%,变异系数大小依次为叶片宽度、总花梗长、花被长、叶数、花梗长、根茎直径、茎秆直径、株高、果实直径、叶片长度。其中叶片宽度的变异幅度最大,叶片长度的变异幅度最小。聚类分析将305份福建黄精种质划分为5大类:第一类以多花黄精为主,叶片性状丰富,叶片和茎秆颜色以全株绿色为主;第二类主要包含了长梗黄精,平均花梗长为11.2 cm;第三类是阿里黄精,轮生花序;第四类是互卷黄精,全株绿色;第五类是滇黄精,叶片数量多且叶宽较小。从分类结果结合形态性状多样性可知,叶形、根茎形状、叶片宽度、叶片和茎秆颜色及总花梗长这4个性状在多花黄精分类上具有良好的区分效果。2福建省多花黄精SSR位点含量丰富目前还没有多花黄精基因组数据,本试验对福建省多花黄精种质进行测序,并获得多花黄精全长转录组数据,通过数据分析可知:共在34748条序列上搜索到63263个SSR位点。通过结构分析在5681个isoforms中共鉴定到4516个SSRs位点。多花黄精中的SSR出现的频率较高,含一个以上SSR位点的序列数为15986条,含有复合物形式SSR位点的序列有13563个。包括二碱基重复(47673个)、三碱基重复(10577个)、四碱基重复(1993个)、五碱基重复(1086个)和六碱基重复(1934个)五种SSR类型,其中二核苷酸,占比达到了75.37%,尤其是AG/CT的频率最高,占48.6%。研究结果表明多花黄精SSR位点类型丰富、具有较高的多态性,可为多花黄精SSR分子标记开发和利用、种质资源的遗传多样性分析、分子标记辅助选择育种等方面提供的理论基础。3基于福建多花黄精全长转录组测序数据开发SSR引物基于福建多花黄精全长转录组数据,使用DNAMAN对筛选得到的SSR位点进行SSR引物设计,随机挑选了56对引物进行合成。经过筛选共有46对SSR标记引物能扩增出清晰的片段。经过复筛,挑选出了19对多态性高,重复性好的SSR标记引物。利用这19对引物对96份形态差异较大的多花黄精种质进行PCR扩增,均能扩增出清晰谱带,并且重复性好,准确度高。对其中60份差异较大的福建黄精种质进行聚类分析,可分为五类:第一类以多花黄精为主,叶片呈披针形,花梗长度较短;第二类为长梗黄精种质,植株全株紫色,花梗类型为长梗;第三类包含大叶的多花黄精和阿里黄精,叶片较宽,叶片与茎秆颜色基本为绿色;第四类主要以多花黄精为主,植株形态性状多为绿叶紫梗,且叶形种类较多;第五类包含滇黄精和多花黄精,植株株高较低。SSR聚类分析结果与形态学标记分类结果基本一致,综上所述:多花黄精SSR标记重复性好且具有丰富的多态性。4基于ISSR分子标记的福建多花黄精遗传多样性分析ISSR分子标记在黄精属植物中应用较广,可用于对比分析多花黄精SSR分子标记的可靠性和准确性,本试验利用DNA质量高的福建黄精种质对多花黄精ISSR引物进行筛选,基于UBC通用引物筛选出9条多态性高的引物,并利用这9条ISSR引物对筛选过的96份多花黄精种质DNA进行PCR扩增。结果表明,9条引物共扩增出多态性条带185条,平均多态性百分比为98.95%,平均每条引物扩增出20.55个位点。9条引物中扩增位点数最多的引物是UBC855,有23个位点;扩增位点数最少的引物是UBC843,有13个位点。试验结果表明,引物UBC855能够较好地揭示不同黄精材料之间的遗传多样性,同时也表明该部位多花黄精基因组高度遗传变异,该扩增位点遗传多样性丰富。对其中60份差异性较大的多花黄精种质进行聚类分析,大致可分为四大类:第一类以绿叶紫梗、叶片披针形为主,鉴定为多花黄精;第二类平均总花梗超过10 cm,叶片和根茎颜色都是紫色,结合形态学性状鉴定为长梗黄精;第三类是大叶的多花黄精,都是绿叶紫梗植株,叶片较宽;第四类包含阿里黄精和多花黄精,大部分是全株绿色植株,部分绿叶紫梗。该聚类结果与多花黄精形态学标记聚类结果都能鉴别出长梗黄精,说明多花黄精ISSR标记引物可以应用于多花黄精种质的鉴定工作中。5福建多花黄精SSR标记与ISSR标记及形态学标记的比较分析从福建黄精ISSR扩增结果来看,9条ISSR引物共扩增出多态性条带185条,平均多态性百分比为98.95%。比较分析可知:多花黄精SSR分子标记与ISSR分子标记均表现为高多态性,而SSR引物标记的多态性高于ISSR。SSR标记将多花黄精种质分为五大类,ISSR标记将多花黄精种质分为四大类,两种标记重合率为70%,表明开发的多花黄精SSR引物在亲缘关系分析等研究领域中有一定的可靠性和稳定性。结合形态学性状的研究、扩增结果及ISSR分子标记等研究结果分析可知:多花黄精SSR标记聚类结果与其形态学分类结果更相近,多花黄精SSR分子标记的开发可用于多花黄精品种鉴定分类及亲缘关系分析等研究领域。