CD133+肿瘤干细胞在消化系肿瘤中的分离、鉴定及其生物学特性的研究

这是一篇关于CD133,消化系肿瘤,肿瘤干细胞,靶向治疗的论文, 主要内容为背景 肿瘤是全球范围内严重危害人类生命健康的重大疾病之一,世界上每年因罹患肿瘤而丧失生命的人约占总死亡人数的20%。随着科学家们对原发肿瘤的生长、浸润、转移和复发以及组织微环境等因素研究的逐步深入,肿瘤的诊断与治疗方法也取得了很大进展,目前已有的治疗手段包括手术、放疗和化疗等,但是这些治疗仍然存在治愈率低、药物副作用大、肿瘤转移与复发等诸多问题。近年来,越来越多的研究提示肿瘤的起源、发生、转移与复发的原因可能是肿瘤内存在极少量具有干细胞特性的细胞,即肿瘤干细胞(Tumor Stem Cells, TSCs)。 肿瘤干细胞有以下特点：第一、自我更新能力：将这些细胞在无血清培养基中培养,能够增殖形成与原代细胞相同的子代细胞；第二、多向分化潜能：将这些细胞在含血清培养基中进行培养,可分化成各种不同的肿瘤细胞,但是在特定的环境中这种分化潜能具有定向性；第三、高致瘤性：将极少量这些细胞接种于NOD/SCID小鼠体内即可形成肿瘤；第四、存在与干细胞相似的信号传导通路：Wnt、Shh、Notch、Bmi和HH-GLI等;第五、高迁徙和转移能力：肿瘤的转移在很大程度上是由于肿瘤干细胞的存在以及其通过各种途径进行的迁移造成的;第六、对射线和药物不敏感：肿瘤干细胞绝大多数处于静止期,而射线和药物以增殖期的肿瘤细胞为作用对象；第七、多药抗药性：研究表明肿瘤可以同时对多种药物产生耐药性,这与肿瘤干细胞表面存在的ABCG5蛋白有关,这种蛋白具有外排药物的作用,因此可以识别药物的共同抗原或者抗体部分,进而将吞噬入细胞的药物外排出细胞,即对多种药物产生耐药性。 CD133作为肿瘤干细胞的表面标志物最早是在脑肿瘤中发现的,Singh等从神经节胶质瘤、星形胶质母细胞瘤中成功地分离出CD133+肿瘤干细胞,并将其在体外无血清培养基中进行细胞培养,发现这种细胞能形成神经球样克隆,具有自我更新和分化能力,同时能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤,肿瘤细胞的亚型与原位肿瘤一样,而且也能连续传代。另外,研究证明CD133+细胞在肝癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、喉癌、胃癌、肾癌等多种实体瘤研究中发挥重要作用,CD133成为分离培养和鉴定肿瘤干细胞的特异性标志之一。近几年针对肿瘤干细胞的研究,更注重从其分子和基因水平等方面进行分析,结果表明CD133这种细胞表面粘附分子与其他细胞因子以及肿瘤微环境的形成,共同参与肿瘤的生长、转移、复发、细胞信号传导通路的调节以及放化疗抵抗的作用。因此,我们可以从阻断肿瘤干细胞的细胞周期、阻断信号传导通路的激活、改变放化疗作用靶点、干扰肿瘤干细胞微环境等方面开展针对肿瘤干细胞表面标志物CD133以及肿瘤相关途径的靶向治疗。 目的 1.探讨CD133+肿瘤干细胞在消化系肿瘤中的存在及生长情况； 2.探讨CD133+肿瘤干细胞的自我更新能力； 3.探讨CD133+肿瘤干细胞的分化能力； 4.探讨CD133+肿瘤干细胞的致瘤性； 5.探讨CD133与肿瘤分子靶向治疗的临床意义与研究前景。 材料与方法 1.标本来源： 河南省人民医院和郑州大学第一附属医院2010年05月-2010年11月肝胆外科和普外科的共15例肿瘤标本,其中胃癌5例、结肠癌5例、肝癌5例。 2.实验方法 2.1取手术切除的新鲜肿瘤组织,通过机械分离、胶原酶消化、滤网收集细胞,红细胞裂解液去除红细胞后,用RPMI1640无血清培养基(SFM)重悬为单细胞悬液。 2.2制备成2×107/m1细胞悬液,加入FcR阻断剂、PE-抗人CD133抗体,用流式细胞仪检测CD133+细胞的比例,并分选出CD133+和CD133-细胞。 2.3将分选所得的CD133+细胞、CD133-细胞和未分选细胞分别接种于RPMI1640无血清培养基(SFM)中,置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养,每天观察细胞形态及CD133+细胞肿瘤球形成情况,并进行传代培养。 2.4将分选的CD133+细胞、CD133-细胞和未分选细胞分别接种于96孔板上,在第1、3、5、7、9、15天用MTT比色法测定各种细胞的增殖状态,以吸光度和生长天数分别为纵轴和横轴绘制生长曲线,并且通过曲线来比对这3组细胞的增殖速度。 2.5将分选的CD133+细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基(SSM)中,置37℃、5%CO2饱和温度的培养箱中培养,分别在培养的第1、4、8、12天用FCM动态检测CD133+细胞的百分比。 2.6取处于对数生长期的CD133+和CD133-细胞,制成细胞悬液,分别取500个、2×104个两种细胞注射于非肥胖型糖尿病／重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠腋窝及背部皮下,观察NOD/SCID小鼠肿瘤形成情况。 结果 1.流式细胞仪检测CDl33+细胞的表达： CD133+细胞阳性率为胃癌0.6%-1.0%,结肠癌1.9%-2.6%,肝癌0.8%-1.3%。 2.CD133+肿瘤细胞的体外培养： CD133+细胞在SFM中能够悬浮生长、增殖,随着培养天数增多,细胞逐渐聚集并形成悬浮的肿瘤细胞球,同时还能连续传代培养。 3.CD133+细胞体外增殖能力检测： CD133+细胞在SFM中有较强的体外扩增能力,曲线陡直,在1-3 d和5-7d更见显著；未分选细胞次之,生长曲线平缓；而CD133-细胞的曲线最为平坦,提示细胞体外增殖能力较弱。 4.CD133+细胞体外分化能力检测： CD133+细胞在SSM中能够分化形成贴壁生长的细胞,与原发肿瘤细胞相似,培养12天,CD133+细胞比例由92.01%下降至4.33%。 5.致瘤性观察： CD133+肿瘤细胞即使细胞数量少也有高致瘤性,500个CD133+肿瘤细胞就可以在非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内形成肿瘤,而CD133-细胞不能形成肿瘤。 结论 1.消化系肿瘤中存在CD133+细胞,但是数量较少； 2.CD133+细胞在无血清培养基中能生长形成肿瘤球,并能连续传代； 3.CD133+细胞在含血清培养基中逐渐分化成与原发肿瘤相似的细胞； 4.较少量CD133+细胞即具有高致瘤性； 5.CD133可能是消化系肿瘤干细胞表面标志物之一,利用CD133作为肿瘤治疗的分子靶向标志,可以为肿瘤分子靶向治疗提供途径。

恶性胶质瘤细胞系的建立及其肿瘤干细胞生物学特性的初步研究

这是一篇关于恶性胶质瘤,细胞系,肿瘤干细胞,生物学特性,细胞培养,动物模型的论文, 主要内容为脑肿瘤是成人危害性极大的恶性肿瘤之一，儿童因肿瘤而死亡的主要肿瘤类型，发病率和死亡率不断升高，严重的威胁着人类的健康和生命。在过去25年里，原发恶性脑肿瘤病人一直在增加，尤其在中年人以每年1.2％的速率在增加。2006年，在美国约有18120个新发脑肿瘤病人，其中约12820个死亡。多形性胶质母细胞瘤(gliobastona multiforme，GBM)，颅内肿瘤分类属星形细胞瘤Ⅲ-Ⅳ级，是最常见的颅内原发肿瘤之一，约占成人因肿瘤而死亡总人数的2.3％。多形性胶质母细胞瘤病人占所有胶质瘤病人的一半以上，在北美每年约有8000到10000的新发病例，发病高峰多在45岁至55岁之间。近十年来，虽然对该肿瘤的病理生理特性有了进一步的理解，但是其治疗没有任何进展。经外科手术、甚至联合放疗与化疗，患者愈后仍很差，其中位生存期无明显改善，一般在9-12个月之间，且病人几乎无一例外的会出现肿瘤复发。 最近研究发现，脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞(Brain tumor stem cell，BTSC)，是引发肿瘤并维持脑肿瘤生长的细胞来源(Tumor-initiating cell，TIC)，肿瘤干细胞可耐化疗、耐放射，在肿瘤的复发过程中起着决定性的作用。BTSC是一群具有自我更新和重建原肿瘤组织表现型的肿瘤细胞，它具有三大特点即：无限增殖、自我更新、多潜能分化。在肿瘤球培养基(tumor sphere medium，TSM)培养条件下，可以形成典型的神经球样结构，并可表达一系列神经干细胞(Neural stem cell，NSC)特异性标记，如CD133、musashi、Nestin、bmi-1、PSP、melk等。在诱导分化条件下，可以分化表达神经元和胶质细胞标记的肿瘤细胞，其表现型与来源肿瘤样本相同。 因此建立体外培养的恶性胶质瘤细胞系及分离培养肿瘤干细胞为进一步研究脑肿瘤的发病机制和细胞生物学特性，为探索新型药物治疗该肿瘤提供了一个较理想的实验模型。 目的： 1．建立GBM细胞系，初步探讨其生物学特性 2．分离、培养及鉴定GBM肿瘤干细胞，初步探讨生物学特性 方法： 1．GBM原代细胞生长的体外培养条件优化 进行GBM原代细胞培养时，分别采用不同的细胞分离、纯化方法和培养条件，优化最适合GBM的培养条件。分离方法优化：分别采用机械分离法、胰酶消化法；纯化方法优化：差异贴壁法、胶原酶消化法；培养条件优化：培养基分别使用DMEM、RPMI1640、DMEM／F12。 2．建系细胞株生物学特性初步研究 (1)体外实验研究：光镜、电镜下观察细胞形态及超微结构、MTT法检测细胞生长曲线及药物敏感性、克隆形成实验了解细胞增殖特性、染色体核型分析探讨细胞遗传学特性。 (2)体内实验研究：裸鼠原位接种检测该细胞株的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性。 3．GBM肿瘤干细胞分离、培养与鉴定 通过条件培养基分离、培养GBM干细胞；细胞计数法、有限稀释实验及流式细胞仪对肿瘤干细胞进行鉴定；原位接种肿瘤干细胞于裸鼠检测该细胞的致瘤性，组织化学染色观察其病理学特性，进行体内鉴定。 4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨 通过RT-PCR比较单层贴壁生长肿瘤细胞与肿瘤干细胞相关基因表达的差异。通过流式细胞仪(flow cytometry，FCM)比较单层贴壁生长细胞与肿瘤干细胞细胞周期、细胞亚群(subpopulation，SP)细胞比例及CD133阳性细胞含量的差异。 结果： 1．原代GBM细胞分离培养条件： 最适合的条件是机械分离法分离细胞后、差异贴壁与消化纯化法相结合纯化细胞、用含10％胎牛血清DMEM／F12培养基进行培养。 2．GBM细胞系生物学特性的初步研究： (1)体外实验结果：光镜下GBM细胞系形态多样，细胞贴壁能力有所差异；电镜下胞核外形不规则，可见假性核内包涵体，核分裂易见；胞浆内细胞器明显增多，可出现发育不良的细胞器，也可见胶质丝；该细胞系群体倍增时间约为60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，亚四倍体占分析核型的35％，余可见单倍体、超三倍体等核型；顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对GBM细胞均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系；DDP、VP-16、TANⅡA作用GBM细胞第三天，IC50分别为7.5mg／L、85mg／L、和0.12mg／L，差异有统计学意义(P＜0.01)。TANⅡA的细胞毒作用最强，其次为DDP，VP-16对细胞的抑制作用最小。 (2)体内实验结果：1×105GBM细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为100％，且裸鼠肿瘤的病理组织形态及组织再培养细胞形态学观察与原有肿瘤组织及细胞相似，裸鼠移植瘤组织中表达胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(+)与神经巢蛋白(Nestin)(+)。 3．GBM肿瘤干细胞分离培养与鉴定： 通过条件培养可分离培养出GBM肿瘤干细胞；BTSC具有自我更新能力；BTSC细胞生长周期约为150h，GBM中具有自我更新能力的细胞约占1.33％。肿瘤球中40.2％细胞表达CD133，9.1％的细胞为SP细胞。通过裸鼠原位接种结果显示：1000个GBM肿瘤干细胞接种裸鼠可形成肿瘤，成瘤率为50％，2万组GBM肿瘤干细胞接种裸鼠成瘤率为80％。移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，表达CD133(+)、GFAP(+)及Nestin(+)蛋白。 4．GBM肿瘤干细胞生物学特性的初步探讨 与单层贴壁细胞比较，肿瘤干细胞乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、CD133、Nestin、Wnt基因mRNA表达增强，GFAP、PTEN基因mRNA表达减弱(P＜0.05)。单层贴壁细胞与肿瘤干细胞细胞周期分布、SP细胞比例及CD133表达含量均有差异(P＜0.05)：肿瘤干细胞增殖指数为25.6％，处于G0／G1期细胞数为74.4％、SP细胞含量为9.1％、CD133+细胞含量40.2％；单层贴壁细胞增殖指数为34.6％，处于G0／G1期细胞数为65.4％、SP细胞含量0.1％、CD133+细胞含量1.3％。 结论： 1．成功的建立了GBM原代细胞系，优化了GBM原代培养条件。 2．该细胞系倍增时间60h，克隆形成率为4.04％，以非整倍体核型为主，可异种移植成瘤，鼠瘤组织表达GFAP、Nestin蛋白，提示建系成功。可为进一步研究GBM的发病机制和细胞分子生物学特性提供较理想的体内外实验模型。 3．顺铂、鬼臼乙甙、丹参酮ⅡA对该GBM细胞系均有显著的细胞毒作用，并呈剂量和时间效应关系，为研发新型药物治疗该肿瘤提供了实验依据。 4．GBM肿瘤细胞中存在1.33％具有异常增殖能力的BTSC；可以利用条件培养基成功分离和培养BTSC；BTSC在TSM培养环境中可以增殖，形成连续传代的脑肿瘤干细胞球。 5．BTSC表面标志物的检测：肿瘤球中40.2％的细胞为CD133阳性细胞，约9.1％的细胞为SP细胞。 6．条件培养基培养后的GBM细胞仅1000即可在裸鼠原位成瘤；移植瘤与人体来源的原发肿瘤组织病理表现型一致，裸鼠移植瘤组织中表达CD133、GFAP及Nestin蛋白，可以作为研究GBM的动物模型。 7．GBM干细胞与单层贴壁细胞相比生物学特性有所改变。相关基因表达的改变：与单层贴壁生长GBM细胞相比，BCRP-1、CD133、Nestin、Wnt mRNA表达较SSM培养细胞增强，GFAP、PTEN表达减弱；细胞周期分布、蛋白表达的改变：与单层贴壁细胞相比，GBM干细胞增殖指数降低，处于静止期细胞数量增加。SP细胞含量增加了91倍、CD133+细胞含量增加了30.92倍。体内成瘤活性增强。

辣椒素通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥抗癌作用的机制研究

这是一篇关于前列腺癌,肿瘤干细胞,辣椒素,Wnt/β-catenin,LiCL的论文, 主要内容为[目的]选取人前列腺癌细胞株PC-3作为研究对象,采用前列腺癌细胞无血清悬浮培养克隆成球法建立前列腺癌干细胞模型。探讨经典Wnt通路对前列腺癌干细胞的调控作用,研究辣椒素是否对前列腺癌干细胞发挥抑制作用以及Wnt/β-catenin信号通路在其中的具体作用机制。本研究为揭示前列腺癌干细胞靶向干预的分子基础,阐明辣椒素对前列腺癌的干预效应及分子机制提供重要科学依据。[方法]1.无血清悬浮培养法(serum-free medium,SFM)富集干细胞肿瘤球,分别采用实时定量 PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测有血清贴壁培养(serum-suffiicient medium,SSM)组和无血清悬浮培养(SFM)组中肿瘤干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133、CD144 等)的 mRNA 和蛋白表达情况。2.细胞计数试剂盒法(cell counting kit 8,CCK8)检测不同浓度的辣椒素对前列腺癌干细胞活力的影响。3.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞增殖相关因子PCNA和P21的蛋白表达水平的影响。4.实时定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax以及前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的mRNA和蛋白水平的改变。5.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞上皮-间质转变(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关因子(Zo-1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin等)的蛋白表达水平的影响。6.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对Wnt信号通路相关蛋白(p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc、CyclinD1、Wnt2)和细胞核中β-catenin的蛋白表达水平的影响。7.蛋白免疫印迹法检测Wnt信号通路相关标记物(Wnt2、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc)的表达情况,阐明辣椒素联合LiCL对前列腺癌干细胞中Wnt信号通路的作用情况。8.细胞计数试剂盒法检测辣椒素联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞活力的影响。9.蛋白免疫印迹法检测前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的蛋白水平的改变,阐明辣椒素联合Wnt通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞干性的影响。[结果]1.无血清悬浮培养法富集前列腺癌干细胞 在未添加血清的培养基中,连续培养前列腺癌PC-3细胞,直至肿瘤球发生凋亡而解体。显微镜下每日观察发现,PC-3细胞成球状聚集生长,随着时间的延长,球体逐渐增大且颜色逐渐加深,培养7日后球体生长速率开始下降,10后逐渐走向凋亡。用SSM和SFM法分别培养细胞7日后,Western blot和qPCR结果显示,SFM组中前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的表达水平上调(P<0.01)。2.CAP抑制前列腺癌干细胞的活力 用不同浓度的CAP处理前列腺癌干细胞PC-3肿瘤球5天,检测CAP对前列腺癌干细胞活力的影响。显微镜下观察发现,与空白组比较,辣椒素可以显著抑制前列腺癌干细胞球的生长,缩小肿瘤球的体积。此外,CCK-8结果显示,CAP能降低前列腺癌干细胞的活力(P<0.05),10μM浓度的辣椒素对前列腺癌干细胞抑制作用最为显著。3.CAP抑制前列腺癌干细胞增殖促进前列腺癌干细胞凋亡 0、1μM、5μM、10μM浓度辣椒素干预后,Western blot结果显示,P21表达水平上调、PCNA表达水平下调;Bax表达水平上调、Bcl-2表达水平下调。qPCR结果显示,Bax表达水平上调、Bcl-2表达水平下调。4.CAP抑制前列腺癌干细胞干性标志物表达 qPCR和Western blot结果显示CAP使前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的mRNA和蛋白表达水平下调,并具有一定程度的浓度依赖性。5.CAP抑制前列腺癌干细胞EMT进程Western blot结果显示1μM、5μM、10μM浓度辣椒素干预后,EMT相关标志物Zo-1、E-cadherin表达水平上调,Vimentin、N-cadherin表达水平下调。6.CAP抑制前列腺癌干细胞Wnt信号通路活性 不同浓度的CAP处理前列腺癌干细胞PC-3肿瘤球5天收集蛋白,Western blot结果显示CAP显著抑制了前列腺癌干细胞Wnt/β-catenin 信号通路活性,主要表现为 Wnt2、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc 以及CyclinD1蛋白水平的下调。结果还显示不同浓度CAP干预前列腺癌干细胞后,其胞核β-catenin的蛋白水平以浓度依赖性的方式下降。7.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞Wnt信号通路的影响 实验分为空白组、10μM CAP组、10mM LiCL组和10μM CAP联合10mM LiCL(混合)组。以上4种处理方式处理前列腺癌干细胞5天后,Western blot结果显示,与空白组比较,LiCL组中标志物GSK-3β表达水平下降,p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-myc表达水平上升,10μM CAP组中标志物GSK-3β表达水平上调,p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-myc表达水平下调;与10μM CAP组比较,混合组GSK-3β蛋白表达水平下调,p-GSK-3β(Ser9)、c-Myc、β-catenin蛋白表达水平上调。8.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞活性的影响 实验分组及处理同上,CCK-8结果显示,与空白组比较,10mM LiCL组肿瘤球活力上升,10μM CAP组肿瘤球活力下降;与10μM CAP组比较,混合组肿瘤球活力上升(P<0.05)。9.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞干性的影响 实验分组及处理同上,Western blot结果显示,与未用辣椒素干预的空白组相比,10mM LiCL组CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2 表达水平上调,10μM CAP 组 CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2表达水平下调;与10μM CAP组比较,混合组CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2表达水平上调。[结论]1.无血清悬浮培养法能够有效富集前列腺癌干细胞;2.CAP影响前列腺癌干细胞的活力并抑制其增殖促进其凋亡;3.CAP抑制前列腺癌干细胞干性标志物的表达并影响其EMT进程;4.CAP抑制Wnt/β-catenin信号通路活性;5.CAP靶向Wnt/β-catenin信号通路,影响前列腺癌干细胞活性及干性标志物表达。

辣椒素通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥抗癌作用的机制研究

这是一篇关于前列腺癌,肿瘤干细胞,辣椒素,Wnt/β-catenin,LiCL的论文, 主要内容为[目的]选取人前列腺癌细胞株PC-3作为研究对象,采用前列腺癌细胞无血清悬浮培养克隆成球法建立前列腺癌干细胞模型。探讨经典Wnt通路对前列腺癌干细胞的调控作用,研究辣椒素是否对前列腺癌干细胞发挥抑制作用以及Wnt/β-catenin信号通路在其中的具体作用机制。本研究为揭示前列腺癌干细胞靶向干预的分子基础,阐明辣椒素对前列腺癌的干预效应及分子机制提供重要科学依据。[方法]1.无血清悬浮培养法(serum-free medium,SFM)富集干细胞肿瘤球,分别采用实时定量 PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测有血清贴壁培养(serum-suffiicient medium,SSM)组和无血清悬浮培养(SFM)组中肿瘤干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133、CD144 等)的 mRNA 和蛋白表达情况。2.细胞计数试剂盒法(cell counting kit 8,CCK8)检测不同浓度的辣椒素对前列腺癌干细胞活力的影响。3.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞增殖相关因子PCNA和P21的蛋白表达水平的影响。4.实时定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞凋亡相关因子Bcl-2和Bax以及前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的mRNA和蛋白水平的改变。5.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对前列腺癌干细胞上皮-间质转变(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关因子(Zo-1、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin等)的蛋白表达水平的影响。6.蛋白免疫印迹法检测不同浓度辣椒素对Wnt信号通路相关蛋白(p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc、CyclinD1、Wnt2)和细胞核中β-catenin的蛋白表达水平的影响。7.蛋白免疫印迹法检测Wnt信号通路相关标记物(Wnt2、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc)的表达情况,阐明辣椒素联合LiCL对前列腺癌干细胞中Wnt信号通路的作用情况。8.细胞计数试剂盒法检测辣椒素联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞活力的影响。9.蛋白免疫印迹法检测前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的蛋白水平的改变,阐明辣椒素联合Wnt通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞干性的影响。[结果]1.无血清悬浮培养法富集前列腺癌干细胞 在未添加血清的培养基中,连续培养前列腺癌PC-3细胞,直至肿瘤球发生凋亡而解体。显微镜下每日观察发现,PC-3细胞成球状聚集生长,随着时间的延长,球体逐渐增大且颜色逐渐加深,培养7日后球体生长速率开始下降,10后逐渐走向凋亡。用SSM和SFM法分别培养细胞7日后,Western blot和qPCR结果显示,SFM组中前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的表达水平上调(P<0.01)。2.CAP抑制前列腺癌干细胞的活力 用不同浓度的CAP处理前列腺癌干细胞PC-3肿瘤球5天,检测CAP对前列腺癌干细胞活力的影响。显微镜下观察发现,与空白组比较,辣椒素可以显著抑制前列腺癌干细胞球的生长,缩小肿瘤球的体积。此外,CCK-8结果显示,CAP能降低前列腺癌干细胞的活力(P<0.05),10μM浓度的辣椒素对前列腺癌干细胞抑制作用最为显著。3.CAP抑制前列腺癌干细胞增殖促进前列腺癌干细胞凋亡 0、1μM、5μM、10μM浓度辣椒素干预后,Western blot结果显示,P21表达水平上调、PCNA表达水平下调;Bax表达水平上调、Bcl-2表达水平下调。qPCR结果显示,Bax表达水平上调、Bcl-2表达水平下调。4.CAP抑制前列腺癌干细胞干性标志物表达 qPCR和Western blot结果显示CAP使前列腺癌干细胞标志物(ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2、CD133等)的mRNA和蛋白表达水平下调,并具有一定程度的浓度依赖性。5.CAP抑制前列腺癌干细胞EMT进程Western blot结果显示1μM、5μM、10μM浓度辣椒素干预后,EMT相关标志物Zo-1、E-cadherin表达水平上调,Vimentin、N-cadherin表达水平下调。6.CAP抑制前列腺癌干细胞Wnt信号通路活性 不同浓度的CAP处理前列腺癌干细胞PC-3肿瘤球5天收集蛋白,Western blot结果显示CAP显著抑制了前列腺癌干细胞Wnt/β-catenin 信号通路活性,主要表现为 Wnt2、p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-Myc 以及CyclinD1蛋白水平的下调。结果还显示不同浓度CAP干预前列腺癌干细胞后,其胞核β-catenin的蛋白水平以浓度依赖性的方式下降。7.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞Wnt信号通路的影响 实验分为空白组、10μM CAP组、10mM LiCL组和10μM CAP联合10mM LiCL(混合)组。以上4种处理方式处理前列腺癌干细胞5天后,Western blot结果显示,与空白组比较,LiCL组中标志物GSK-3β表达水平下降,p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-myc表达水平上升,10μM CAP组中标志物GSK-3β表达水平上调,p-GSK-3β(Ser9)、β-catenin、c-myc表达水平下调;与10μM CAP组比较,混合组GSK-3β蛋白表达水平下调,p-GSK-3β(Ser9)、c-Myc、β-catenin蛋白表达水平上调。8.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞活性的影响 实验分组及处理同上,CCK-8结果显示,与空白组比较,10mM LiCL组肿瘤球活力上升,10μM CAP组肿瘤球活力下降;与10μM CAP组比较,混合组肿瘤球活力上升(P<0.05)。9.CAP联合Wnt信号通路激活剂LiCL对前列腺癌干细胞干性的影响 实验分组及处理同上,Western blot结果显示,与未用辣椒素干预的空白组相比,10mM LiCL组CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2 表达水平上调,10μM CAP 组 CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2表达水平下调;与10μM CAP组比较,混合组CD133、ALDH1A1、OCT-4、Nanog、SOX2表达水平上调。[结论]1.无血清悬浮培养法能够有效富集前列腺癌干细胞;2.CAP影响前列腺癌干细胞的活力并抑制其增殖促进其凋亡;3.CAP抑制前列腺癌干细胞干性标志物的表达并影响其EMT进程;4.CAP抑制Wnt/β-catenin信号通路活性;5.CAP靶向Wnt/β-catenin信号通路,影响前列腺癌干细胞活性及干性标志物表达。

人卵巢癌细胞系A2780的肿瘤干细胞的分离培养和鉴定

这是一篇关于肿瘤干细胞,卵巢癌,A2780,CD133的论文, 主要内容为研究背景: 研究发现恶性肿瘤的发生、发展、转移和复发的特点与正常干细胞极其相似。干细胞是一类未分化的细胞群,具有自我更新和多向分化能力,并保留非对称复制的生物学表型。大量研究表明,许多实体瘤及血液系统肿瘤起源于肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)。这种细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化和在体内形成肿瘤的能力,并促进肿瘤不断生长,是肿瘤发生、复发和转移的根源。 近十几年,已从多种肿瘤如白血病、乳腺癌、脑肿瘤、肺癌,前列腺癌、胰腺癌等分离并鉴定出CSCs,使肿瘤干细胞理论取得了实质性突破。肿瘤干细胞与肿瘤的多药耐药、肿瘤休眠及复发密切相关,从而抵制并逃避治疗,导致肿瘤耐药及进展。进一步探索CSCs在肿瘤形成、发展中的具体作用,对肿瘤的治疗有重要意义。 卵巢癌病死率在女性生殖系统肿瘤中高居首位。上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)在卵巢癌中所占比例最高,约90%卵巢癌来源于上皮。因其发病隐匿,早期无特异性症状,缺乏有效的早期诊断措施,大部分患者确诊时已多处于晚期,故死亡率高。最近,已有一些研究开始着眼于分离、鉴定正常卵巢组织及卵巢癌标本中的干细胞,并研究其干细胞特性。 目前主要依据细胞表型特征和生物学特性来分离CSCs。无血清分离培养、流式细胞分选、磁珠分选等方法已成功应用于脑胶质瘤、乳腺癌、肺腺癌等CSCs的分离。其中,无血清培养已成为培养CSCs的经典培养方法。而卵巢癌干细胞的研究刚起步,国内外相关报道甚少。已有一些研究采用持续培养起始细胞、借鉴其它CSCs表面标志标记及染料排除方法,从卵巢癌患者腹水、肿瘤组织及一些细胞系中成功分离出一小群具有干细胞特性的肿瘤细胞亚群。目前已在多种肿瘤中发现一些与肿瘤发生、发展相关的分子表面标记物,并已成功应用于临床医学实践中。CD133是干细胞/肿瘤干细胞的特征性表面标志物之一,在脑肿瘤、肝癌、乳腺癌和结肠癌等肿瘤中己经证实CD133+细胞为CSCs。 目的: 建立一种体外无血清培养方法,从人上皮性卵巢癌细胞系A2780中分离、扩增卵巢癌干细胞。并通过体外连续传代培养,研究该细胞亚群体外自我更新、增殖、分化等生物学特性。对其卵巢癌干细胞的生物学特性和NOD/SICD小鼠体内致瘤能力进行初步鉴定。验证CD133、Oct-4、CD44等作为卵巢癌CSCs标志的合理性,为后续实验奠定基础。 方法: 采用体外无血清培养人上皮性卵巢癌细胞系A2780细胞,分离获得悬浮生长的肿瘤干细胞球样细胞,观察其生物学特性及细胞形态学变化;收集SFM培养中的A2780干细胞球样细胞,将其重悬于SSM内诱导其分化,观察细胞形态学变化;收集A2780干细胞球样细胞、诱导分化后细胞及常规培养的A2780贴壁细胞,经CD133抗体(APC-CD133)标记后,流式细胞仪检测三组细胞内的CD133阳性细胞比例;免疫细胞化学检测干细胞相关表面标志CD133、CD44、CD117在三组细胞内的表达情况;RT-PCR检测干细胞相关基因CD133、Oct-4、Nanog mRNA在三组细胞内的表达情况;将A2780干细胞球样细胞及常规培养的A2780贴壁细胞分别以细胞密度为1×104/ml、1×106/ml皮下接种于NOD/SCID小鼠两前肢腋下左、右两侧(0.1ml/部位),共6只,比较二者成瘤能力。 结果: 人上皮性卵巢癌细胞系A2780中有一小部分的肿瘤细胞可在SFM内存活、形成悬浮生长的细胞球,能连续增殖,可连续传代10代以上,成球比例随传代次数增多而增多,并可逐渐富集,具有自我更新能力。将A2780干细胞球重悬于SSM后出现分化,恢复其原先贴壁生长的特点,且分化后细胞形态与阴性对照无明显差别。流式细胞检测结果显示在第一、三、五、七代A2780球细胞内CD133阳性率分别为7.31%、20.20%、44.33%、92.69%,均显著高于常规SSM培养的A2780细胞1.16%及诱导分化后细胞1.35%。提示CD133阳性率随着传代的次数逐渐升高。而诱导分化前CD133阳性率为94.62%,诱导分化培养第7天细胞CD133阳性率为12.37%,第12天为1.35%,与阴性对照无明显差别。免疫细胞化学检测显示A2780干细胞球经鼠抗人CD133抗体标记后,细胞可见明显的绿色荧光,而CD44、CD117无明显表达。绝大部分常规培养的A2780细胞及诱导分化后细胞CD133、CD44、CD117均无明显表达。RT-PCR检测干细胞标志Oct-4、Nanog也在细胞球内较高表达,而常规培养的A2780细胞及诱导分化后细胞无明显表达或表达较低。SFM培养的第七代A2780卵巢癌肿瘤干细胞球样细胞接种于NOD/SICD小鼠,3周后开始成瘤,5周后所接种的6只NOD/SCID小鼠中6只成瘤。而SSM培养的A2780贴壁细胞接种5周后均未成瘤。CD133+细胞具有更强的致瘤力。 结论: 无血清培养方法分离卵巢癌细胞系A2780的肿瘤干细胞简便易行,并可进一步扩增、富集卵巢癌CSCs,此法可作为分离、纯化卵巢癌CSCs的一种实用、简易且行之有效的方法。 无血清培养法分离的人卵巢癌细胞系A2780干细胞球样细胞具有肿瘤干细胞特性:自我更新、多向分化和无限增殖等能力;并较SSM培养的贴壁细胞明显高表达CD133、Oct-4、Nanog等肿瘤干细胞标志,且CD133+细胞具有更强的致瘤能力,提示CD133+A2780细胞是卵巢癌CSCs。

人卵巢癌干细胞的分离培养和初步鉴定

这是一篇关于卵巢肿瘤,肿瘤干细胞,肿瘤球状体细胞,无血清培养基，悬浮培养的论文, 主要内容为目的从人卵巢癌SKOV-3细胞中分离和培养卵巢癌干细胞,并鉴定其生物学性质。 方法人卵巢癌SKOV-3细胞在含有生长因子的无血清培养基(serum free medium, SFM)中悬浮培养得到肿瘤细胞球。流式细胞术、Transwell小室侵袭实验分别检测SKOV-3细胞及其细胞球中CD44和CD117的表达,筛选细胞表面标记物和观察体外侵袭能力；将肿瘤细胞球传代扩增,并用含血清培养基(serum-supplemented medium, SSM)培养诱导其分化；将肿瘤细胞球分别置于含血清和无血清培养基中进行交替培养,使其传代更新,进一步证实卵巢癌干细胞的存在；将肿瘤细胞球和普通人卵巢癌SKOV-3细胞分别接种于96孔板,使用CCK-8法分别检测它们的增殖能力及耐药性。 结果(1)人卵巢癌SKOV-3细胞能在SFM中形成可以稳定传代的肿瘤细胞球,并显示强大的自我更新和增殖能力,含血清环境(SSM)能够诱导其分化而贴壁生长。肿瘤干细胞球可以连续传代,并可交替培养于含10%的胎牛血清培养基(serum-supplemented medium, SSM)和无血清培养基(serum free medium,SFM)中。(2)肿瘤细胞球中高表达CD44和CD117抗原标记,其侵袭能力显著高于普通人卵巢癌SKOV-3细胞(P<0.05)。(3)肿瘤细胞球对顺铂具有很强的耐药性,将顺铂作用于细胞球及贴壁分化细胞24,48及72小时后,细胞球抑制率分别为2.59%、8.43%、12.08%,显著低于贴壁分化细胞(抑制率分别为10.73%、28.13%、39.17%),分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论(1)采用无血清悬浮培养法从人卵巢癌细胞系中获得的细胞球可能含有一小部分具有自我更新和多向分化潜能的卵巢癌干细胞,其可以在含有生长因子的无血清培养基中形成悬浮状态生长的肿瘤细胞球、并可以多次传代；高度表达干细胞标志物CD44和CD117抗原标记,且CD44更具有特异性。因此,人卵巢癌SKOV-3中的肿瘤干细胞可以采用无血清悬浮法初步富集。(2)人卵巢癌干细胞球比普通卵巢癌细胞更具有侵袭能力、耐药性。